资源简介

实验一
大肠杆菌的培养和分离
【教材解读】
1.微生物
①细菌：是
，与真核细胞相比，细菌没有
的细胞核，其
由肽聚糖组成。
②大肠杆菌：是
性、异养兼性厌氧的肠道杆菌。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的
，它也是基因工程中常用的
。
【注意：根据细胞壁结构的不同，细菌可分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类；革兰氏
菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；如：金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌。革兰氏
菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素；如：大肠杆菌】
③绝大多数微生物与传染病
，90%以上的微生物是对人类
的。
2.培养基配置
①微生物的生命活动需要五大营养要素：
水、无机盐、
、
、生长因子；
②有的物质既是
又是
（为微生物生长提供碳元素和氮元素），如：蛋白质、蛋白胨；
③有的既是碳源又是
（是微生物生长不可缺少的微量有机物），如：酵母提取物；
④“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌喜
的温度；霉菌喜
℃的温度；
⑤细菌的培养基：蛋白胨、
、一定量的
，以维持一定的
；通常在
的环境中生长；
⑥霉菌的培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可；通常在
的环境中生长；
⑦在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要适宜的
、
以及特殊营养物质，以满足微生物生长对的要求。
3.培养基的种类及用途：
①液体培养基：呈现液态，用于
和
；
②固体培养基：配制时需加入琼脂（凝固剂），呈固态，用于
、
、计数等；
③我们一般用LB
来扩大培养大肠杆菌，用
来分离大肠杆菌。
4.灭菌和消毒（重点内容）
①无菌技术：人们利用微生物完成一定的反应，必须要求某种微生物是没有
的，因此，在培养微生物时必须进行
操作；
②灭菌是用
的方法，杀死或除去环境中的
的方法。
的方法叫消毒。如：实验室要对使用前和使用后的培养基、各种容器进行
；要对实验服、对病人的排泄物和衣物进行
。
③干热灭菌法：是利用火焰将接种环和试管上的微生物烧死（又称
法），或在140-160℃的烘箱中加热2-3h，将微生物的
杀死。【注意：干热灭菌法只适用于
或玻璃用具】
④加压蒸气灭菌法（
法）：这是生产和实验室常用的灭菌法，将灭菌锅内通入压力达到1000g/cm2的
，锅内温度达
℃，持续15-30min，即可达到
目的；
注意：当培养基内有葡萄糖时，为防止葡萄糖
，要用
g/cm2压力（
℃以上）灭菌30min。⑤过滤灭菌法：有些化合物（尿素、碳酸氢钠等）加热会分解，如培养基中需要时，只能配成溶液单独
灭菌；通常用
过滤。其他型号（如：G1-G5）的不能除菌。
【注意：玻璃砂漏斗使用方法：使用前也要用
灭菌，玻璃砂漏斗有6种型号，即G1-G6，G6孔径最
，
不能滤过，在使用后需要用
1mol/L
的
浸泡，并
，再用
洗至洗出液至中性，
后保存】
⑥紫外线光灭菌法：紫外光谱范围是100-400nm，灭菌最有效的波长为253.7nm，它是
，可使菌体的
变性，芽孢可在10min内杀死。注意：紫外线对人的皮肤、眼睛等会造成伤害，开启紫外线灯后，人必须
。
5.灭菌操作：
①各种大小的
、试管、
、取样器的头、移液管、
、
、镊子等等，这些用具通常用
灭菌：
试管需加
或塑料盖；三角瓶可用
或6层纱布封口；移液管上端用镊子放入少量
；取样器的“枪头”放在可灭菌的专用塑料盒中；
b.各种用品均用
或
包好；
c.在121℃（
g/cm2压力）下灭菌15-30min；
d.将实验用具放入60-80℃的
中烘干，以除去灭菌时的
；
e.在进行实验操作前，将需要使用的用具从烘箱中取出，放到
上，然后打开
灯和
，灭菌30min。
②培养基、无菌水等使用
灭菌，所用器械是
锅；
③对不能受潮的实验器具使用
灭菌法。
注意事项：
①实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易
，吸水后容易
。灭菌后，通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的
；
②在将培养基加到三角瓶、试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、培养皿壁上不能
，否则容易
；因此，在将培养基转移到三角瓶或试管中时，必须用
；向培养皿中转移
的培养基时，也不要
；
③在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许
上，接种时要在
旁操作；
④接种时要
，
，这是减少
的关键；
7.细菌的培养和分离
①接种时，先将
在明火上烧红后
，然后蘸取带菌的
，放到新的培养基中；【注意a.取菌种前，灼烧接种环的目：消灭
的微生物；
b.除第一次划线外，其余划线前都要
接种环，目的是：消灭
；
c.取菌种和划线前都要求
后进行，其目的是防止
；
d.实验结束后灼烧接种环的目的：防止
和操作者】
②（划线分离法）用接种环蘸菌液后在含有
的培养皿平板上
，在划线过程中接种环上的菌液逐渐
，因此划线最后部分的细菌间距离
。将接种后的固体培养基培养10～20h后，一个细菌细胞就会繁殖成许多个细菌细胞，紧紧聚集在一起，形成
，菌落不会
。如果再将每个菌落分别接种至含有
的试管
【将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌后将试管
放，令其
，固体培养基即成为斜面】上，在斜面上
，则每个斜面的菌群就是由
个细菌产生的后代。这样的方法也可以用于
，将
除去，这是
法。
③（涂布分离法）先将培养的菌液稀释，通常稀释10-5～10-7倍，取
稀释度
的菌液，加在培养皿的
上，用
涂布在培养基平面上进行培养，在适当的
下，可培养得到
的菌落。通常每个培养皿有
个以内的
最为适合。
【注意：使用玻璃刮刀或镊子时，把从
中取出的刀或镊子放在
上使酒精燃烧，但不要在火焰上加热，
后即可使用】
④
法，方法简单；
法，单菌落更易分开
，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。
8.操作步骤：
①灭菌：在两个250mL的
中分别装入50mL
LB
培养基和50mL
LB
培养基，加上
，将培养基用
包好，放入
内，1000g/cm2压力灭菌15min。
②倒平板：灭菌后，待高压锅或灭菌压力与大气压
时（即没有压力了）打开锅盖。将有培养基的三角瓶和培养皿放到
上，打开
上的紫外线灯和
【注意：打开紫外线灯后人必须离开】，待固体培养基
时，关闭紫外线灯，点燃
，用镊子夹出
擦拭桌面，并用
擦手。在
旁，将三角瓶中的培养基倒在
里，将培养基分别倒至
个
中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于
上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待
后即形成平面。
③接种培养：将接种环在
，再深入到斜面，接种前，应先使接种环接触
以达到
目的，然后再取
，将
放入三角瓶的液体培养基中，将三角瓶的
和
复原。三角瓶在
℃，每分钟200转的
上振荡培养12h。
④划线分离：在酒精灯上灼烧
，将
上培养了12h的菌液打开，接种环
后深入到菌液中，醮取菌液，在
的平板上连续
，接种环只在菌液中
，划线后盖好培养皿。最后，将培养皿
（盖在下面），在37℃
中培养12-24h后，可看到在
端出现不连续的
，表明菌已被分离。
【注意：接种后，培养皿必须
中；因为正放时，水分形成的水滴会落入
表面，水流扩散会使
扩散，很难形成
，就失去了分离菌株的效果；】
⑤保存菌种：在无菌操作下将单菌落用
取出，再用
法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃
中保存。
⑥完成实验后：所有接触过细菌的器皿都必须先
后再
，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也
；使用后的废弃物也要
后再抛弃。
实验2：分离以尿素为氮源的微生物
【教材解读】
1.脲或称
，是
降解的产物；土壤环境中有一些细菌含有
，它们可以通过降解尿素作为其生长的
。尿素分解的化学方程式为：
配制培养基：
①全营养LB固体培养基：
（碳源和氮源）、
（碳源和生长因子）、
（无机盐，调节渗透压）、水、
（去氮纯化后的凝固剂），加上
后
灭菌后待用；
【注意：配制固体培养基时要添加适量
，而不使用
，是为了防止
中的含氮化合物被细菌利用，尽量做到培养基中只有
一种含氮化合物，有利于以
为氮源的细菌的筛选】
②尿素固体培养基：
（碳源）、
（调节渗透压）、K2HPO4（无机盐）、水、
和
（指示剂），加上
后
灭菌后待用；待
时，加入通过
过滤（过滤灭菌法）的10mL
溶液，摇动混合均匀待用。
操作步骤：
①倒平板：在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和
，在酒精灯旁分别倒入两个
中，在水平的
上摇匀，
至凝固；
②制备细菌悬液：在
条件下，将1g土样加到99mL
的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液，依此法制备10-3、10-4和10-5土壤稀释液（
法）。取样时尽量只取
，摇匀后放在试管架上。
③用涂布分离法分离细菌：取10-4和10-5的土壤稀释液各
mL，分别加到LB培养基和
培养基的
中，再将保存在
中的玻璃刮刀放在
上【注意：不能在酒精灯上加热】，待刮刀上
时，在
旁打开培养皿，将
涂布到整个平面上。
④将培养皿
，在37℃
中培养24-48h，观察
。
⑤观察结果：全营养培养基中有
菌落，而尿素为氮源的培养基中
菌落。【原因：能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有
数量】。
⑥指示剂颜色：有脲酶的细菌菌落周围会出现
的环带；【原因：脲酶使尿素分解后产生
，呈
，遇酚红变
色；红色环带出现标志着存在
的作用，从而证明这一菌株可以以
为氮源；红色环状区域的大小代表脲酶活性的
和
】
实验
4：果汁中的果胶和果胶酶
【教材解读】
1.果胶是植物
的主要成分，由
和
组成。山楂的果实中果胶含量
，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是
的作用，果胶起着将植物细胞
的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得
。
2.果胶不溶于
，这是鉴别果胶的一种简易方法；即：添加
可以使果胶析出。
3.果胶可被
和
水解【注意：果胶酶不是一种，而是一类】；果胶水解的最终产物是
【注意：果汁中有果胶，果胶减少了水果组织的
，所以制作果汁时使用果胶酶可使果汁变
，提高
】。
4.一般用于生产果胶酶的微生物有
和
，微生物中提取的果胶酶包含
酶和
酶。
5.实验操作及结果
6.果汁品质好的标准（了解）：
①尽量保留水果中的
；②具有水果的
；③有更多的
；④分散程度
，
，不上浮；⑤有原始的色彩；⑥除去所有的机械组织，更易消化。【注意：能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的条件就是最佳条件】
7.制作果汁加入果胶酶可将
，增加固形物的
；此外，还降低了水果匀浆悬液的
，有利于
，并使果胶分解成
。
8.果胶酶除用于制备果汁外，还用于果酒
，同时也作为
的添加剂，加果胶酶的洗衣粉可除去衣服上的
、
等污垢。
实验
6：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
【教材解读】
1.固定化酶就是将
的酶用
的方法固定在某种
上，使之成为
而又有酶活性的制剂。固定化的方法有
（了解：利用物理或离子交换的方法，将酶蛋白分子吸附在惰性载体上）、共价
（了解：在温和条件下将酶蛋白分子与载体共价结合）、
（了解：以载体将酶蛋白分子相连）
、
（将酶蛋白分子包埋在凝胶交联后的“格子”中）等。
2.固定化酶提高了酶的
，可较长时间地
；可
，更经济，更利于
。
3.淀粉酶是一类能水解
的复合酶；本实验是用
为吸附剂，将α淀粉酶（淀粉酶中的一种）固定在
上，再将
装柱；一定浓度的淀粉溶液经过
柱后，可使淀粉水解成
；用淀粉指示剂（常用KI-I2溶液）测试，流出物呈
。淀粉的水解产物不同，显色也不同。完成下列填空：
4.使用的α淀粉酶通常是由
深层发酵制备，具有较强的液化
的能力，可用于制备
，其最适PH为
，最适温度为
℃；
5.实验操作流程
①α-淀粉酶固定化：在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4mL
中，由于酶不纯，可能会有些
；再中入5g
，不时搅拌，30min后装入一支下端接有气门心并用夹子封住的
中；用
倍体积的
洗涤此注射器以除去
，流速为1mL/min。
②检验固定化酶柱的流出液中是否有淀粉酶：
a.取2支洁净的试管，编号为
A、B，各加入1mL
溶液；
b.A试管中加入5滴
，B试管中加入等量的
，混合后60℃水浴保温5min（或
试管增加温度）；
c.向AB试管各滴加2滴
指示剂，观察溶液颜色变化；
d.若AB试管溶液均为蓝色且颜色相同，则
。
③用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱【目的：流速慢是为了保证
反应所需
】，在流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液，加入1-2滴
溶液，观察颜色；用水稀释1倍后再观察颜色；
④实验后，用
倍柱体积的
洗涤此柱【目的：洗去
】，放置在4℃
中，几天后再重复上述实验，看是否有
。
☆如何测定木瓜蛋白酶亲和柱水解蛋白质？
用滴管分别取等量的
（对照组）和木瓜蛋白酶亲和柱流出液（实验组），加入A、B两支试管中；
向A、B两支试管分别滴加等量的
，振荡均匀，观察颜色变化；
B试管中的颜色与A试管中的颜色有变化【了解：颜色深浅与肽键浓度成正比】，说明
水解了蛋白质【原理：蛋白质被蛋白酶水解后肽键减少，用双缩脲反应测定肽键减少而发生的颜色变化，即可了解酶的水解作用】
实验
8：果酒及果醋的制作
【教材解读】
果酒的制作
1．与酒制作有关的微生物是
（了解：酵母在自然界分布广泛，已知有几百种之多），菌种的不同，所产生的酒的风味
。
2．葡萄酒是酵母利用葡萄糖进行
（乙醇发酵）的产物，酵母菌只有在
条件下才能进行酒精发酵，即将葡萄糖氧化成
，而且当培养液中乙醇的浓度超过
时，酵母菌就会死亡。
3.实验流程：
①冲洗和榨汁：将成熟的紫葡萄先用水洗净，再在鲜红紫色的
溶液【目的：是为了防止
，但是，也消灭了葡萄果实上存在的野生酵母】，中浸泡约5min，然后用
冲洗；沥去水后，将葡萄打成
【注意：尽量别把葡萄籽打碎，否则会影响葡萄酒风味】；
【注意：清洗葡萄时，应先
后
；若不加酵母菌自然发酵时，不能多次清洗，防止果实上的
流失】
②配制酵母液：将适量
放在一小烧杯中，加入少量温水（＜40℃），使干酵母成为糊状；为使酵母迅速发生作用，可加极少量
，混匀，放置片刻，待酵母悬液中出现
即可；
③装瓶：将葡萄浆放入发酵瓶中，装置不要超过容积的
【原因：酒精发酵有气体产生，装满容器会导致发酵液
，造成发酵液损失；也会造成瓶口等处被
，影响产物品质】，然后加入酵母悬液【原因：使
成为优势菌群，抑制
生长，防止出现异味影响质量；同时加速反应，观察现象更直观】，搅拌均匀，瓶上加一软木塞或橡胶塞，塞上有孔，孔中插一有弯曲的装
的玻璃管【目的：a.
，保持
环境；
b.排出产生的
，减少瓶内
；
c.防止空气中的
】。
④将装配好的发酵瓶放在
℃的条件下2-3天；当发酵瓶中
，即表示发酵完毕。若温度偏低，发酵时间相对
；若温度高于30℃，要采取
措施，否则酒的风味不佳。
⑤发酵完毕，将发酵液过滤、除去
；
⑥将获得的滤液分装到
中，加盖密封，
，待沉淀后，
即为葡萄酒。
用纯葡萄制作的葡萄酒不含糖时（俗称“干红”或“干白”），
含量也低（平均的体积分数为8%）。若要制作酒精含量和糖含量都较高的果酒，则发酵液中应该加入一定的
。
用果汁制作果酒：
①制取果汁；
②向发酵瓶中加入
，然后倒入果汁；转动发酵瓶，使
完全溶解，最后倒入酵母悬液，混匀，
；
③3天后可看到
，10天后剧烈的发酵停止，此时即可取出果酒过滤和分装；
④发酵开始时，微生物的有氧呼吸会使发酵瓶内出现
【原因：有氧呼吸消耗容器内的
，产生的CO2溶解到溶液中，导致气体总量
】；
⑤静置5-6个月后，
下沉，上清液即为果酒，可用
法取出。
果醋的制作
1．与醋制作有关的微生物是
，菌种的不同，所产生的醋的风味
；培养醋化醋杆菌的液体培养基配方：蛋白胨、酵母提取物、
（碳源）。
2．醋杆菌只有在
条件下，才能将
氧化为醋酸。用醋杆菌发酵，培养液中醋酸含量可以达到
。
3.流程：
①如图连接发酵装置，将活塞关闭，把800mL
倒入甲瓶中，用铝箔将上口盖住；
②加入醋化醋杆菌：乙瓶是
，醋酸发酵在其中进行；乙瓶内装
至八分满，乙瓶下口有两个孔，其中一个连接丙瓶，下面接一段胶管，通过胶管上的螺丝夹控制
的速率；另一个孔插入一直角玻璃管，管内塞
，不要塞太紧，用以
【目的：防止空气中的
进入】。此管另一端上升至锯末之上；
③发酵并检测
pH
值：将适量醋化醋杆菌的
或醋曲悬液加在200mL
中混匀，并调PH至
后倒入乙瓶中，使锯末均匀
，醋化醋杆菌附着在
上，此瓶中几乎没有
的液体存在；
④通气发酵：将
的出气管与乙瓶上的
连接，通气不必过
，使醋酸发酵48h后，用
检查乙瓶中流出液的PH，若检测结果显
，则可进入下一步。
⑤调节活塞控制流速，以保证
；
⑥每天用
检测流出液的PH，监控发酵进行的情况，等到
不再减少，或甲瓶中的液体
时，停止实验。
实验
10：泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
【教材解读】
泡菜的腌制
1．泡菜腌制过程中起作用的微生物主要是
和
。在
条件下，微生物利用菜中的糖和其他的营养物质进行发酵，发酵产物有
和
等物质，但也含有一定量的对人体有害的致癌物质――
；【需氧发酵产物：乙酸、亚硝酸盐等；无氧发酵产物：醇类、乳酸等】
2.在一定的发酵时间内，泡菜酸度适口，时间过长，则
过多产生霉变味；
3.制作泡菜需要
环境，市场上有专用于制作泡菜的容器，它的口有一凹槽，对凹槽
后再加盖，可造成
条件。
4.流程
①各种菜洗净、切块；
②泡菜坛洗净、消毒；
③将各种蔬菜、
【作用：抑制杂菌和调味】、糖及调味品放入坛，混合均匀；如果希望发酵快些，可将蔬菜在
中浸1min【目的：杀死蔬菜表面杂菌，降低蔬菜中的氧含量，利于进行无氧呼吸】后入坛，再加上一些
【作用：抑制泡菜表面
的生长，同时可起到
作用，增加醇香感】；
④将坛口用水封好，防止
进入【不封口，会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂】；
⑤腌制1周左右即可开坛食用，也可以随时加入新鲜蔬菜，不断取用；
⑥如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经
，可减少
。
5.出现异常：泡菜水上出现一层白膜，这是因为坛沿水槽的水干了，
进入泡菜坛，
大量繁殖形成的菌膜；
6.亚硝酸盐含量变化：通常认为，亚硝酸盐是由需氧菌、假丝酵母产生的；整个过程中，亚硝酸盐含量变化是：先
后
；
亚硝酸盐的定量测定
1.亚硝酸盐与
发生重氮化反应，这一产物再与
偶联形成
色产物，可用
法定量。
2.流程：
①样品处理：腌制的泡菜25g及少量泡菜汤，在匀浆机打成
，用滤纸和
滤至500mL烧杯中，用100mL水洗涤
两次，每次均过滤如上，
滤液，用
溶液将PH调至8，再加入25mL
溶液；摇匀，如不产生白色沉淀，再加入氢氧化钠至
为止【目的：吸附滤液中的残渣和蛋白质等，使滤液
，利于
反应】。在水浴中加热至60℃，10min后，令其冷却至室温，然后用滤纸过滤，用少量水
沉淀2-3次，将
在500mL容量瓶中定容【注意：洗涤匀浆机、残渣、沉淀物的目的是减少样品中亚硝酸盐的流失】。
②测定
的光密度值:取
mL样品溶液，加入4.5mL氯化铵缓冲液、2.5mL60%乙酸溶液和5mL显色液，定容于25mL的容量瓶中。混合均匀，暗处静置25min，用光程为1cm
【比色杯是用来盛装所分析的样品液的容器，如图；光程是指单色光穿过比色杯中样品液的距离，即比色杯两侧内壁之间的距离】在
nm【原理：波长为550nm单色光通过比色杯时，被里面的亚硝酸盐吸收掉一部分，然后照射在光电检测器上。光电检测器将光信号的强弱转变为电信号的大小，最后经放大，由显示部件显示出测量结果——光密度值】处测定
（OD值）。以10mL水为
。
③绘制标准曲线：取0、0.5、1.0、3.0和5.0mL亚硝酸钠标准溶液，分别放在25mL容量瓶中，各加入4.5mL氯化铵缓冲液、2.5mL
60%乙酸溶液和5mL显色液，加水定容，混合均匀，暗处静置25min，用光程为
cm
在550nm处测定光密度值（
）；以
为横坐标，以
为纵坐标，绘制标准曲线。
④根据曲线所得数据，计算每公斤样品中亚硝酸盐的含量（X）：
V2
=测定样品液体积（10mL）；V1
=样品处理液总体积（500mL）
m2
=通过标准曲线得到的亚硝酸盐的质量，
m1
=
样品质量（25g）
实验11
植物的组织培养
【教材解读】
组织培养就是取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在
的条件下接种在
中的琼脂培养基上，给予一定的
，使之产生
，或进而生根发芽。【植物组织培养有两种形式，一种是愈伤组织培养，需用
培养基；一种是细胞悬浮培养，需用
培养基】
在培养基中必须加入
和
，两者的
决定组织是生根，还是生芽。细胞分裂素与生长素的比例高时，诱导
的生长；两者比例大致相等时，愈伤组织
而不
；两者比例低时，才会趋于
。【记忆办法：“生根”“分芽”，即“生长素”所占比例高时生根，细胞分裂素所占比例高时生芽】
菊花组织培养过程：首先用细胞分裂素相对较
和生长素相对较
的培养基（
培养基）进行培养，使长出较多的
；然后将
分株培养【解析：将植物的根、茎基部长出的小分枝与母株相连的地方切断，然后分别培养】。分株后，再移入含有较多
的培养基（生根培养基）中，使其
；将
的苗从三角瓶中移至
中继续生长；苗健壮后再移至土中。
MS培养基：由
、微量元素和
组成；
【NAA，人工合成的生长素类似物】需用少量
溶液溶解，
【BA，人工合成的
类似物】需用少量
溶解。
发芽培养基:3000mLMS培养基+含1.5mg
的溶液+含0.02mg
的溶液+30g
（除作为营养成分外，还具有调节渗透压的作用）+40g
（用做制作固体培养基的凝固剂）；生根培养基：1000mLMS培养基+0.38mg
溶液+30g
+20g琼脂。
操作步骤：
①在
中，取出一瓶已进行过
的菊花幼苗，在
上用
镊子和
解剖刀切成几段，每段至少有
。
②在
旁，将每段放入1瓶
中，使茎的一部分插入
内，盖上
，每瓶也可放入2-3段幼茎切段。
③在
保持18-25℃的温度培养，每天的光照不少于14.5h。
④2-3周后将生长健壮的
在
条件下转入
中，在上述条件下继续培养。
⑤待生根后，将苗移至
中，用玻璃罩或塑料布保持
的湿度，2-3天后打开玻璃罩逐渐
进行锻炼，直到将罩全部打开处于
为止。
⑥再转移至土中培养（定植），即可长成植株并开花。
⑦若使用
的茎进行组织培养，则可取一段茎在
中浸泡10min，再放入
溶液中浸泡5min，然后用另一
溶液浸泡5min，最后在
中用
清洗，将茎的切段培养在
中。【注意：先发芽后生根】
【补充：天然激素在植物体内作用和存在的时间较短，是因为植物体内
；而
分解人工合成激素的酶，所以人工合成激素的作用时间长，作用效果明显】
选修1
教材解读实验一
大肠杆菌的培养和分离
【教材解读】
1.微生物
①细菌：是原核生物，与真核细胞相比，细菌没有核膜包被的细胞核，其细胞壁由肽聚糖组成。
②大肠杆菌：是革兰氏阴性、异养兼性厌氧的肠道杆菌。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞
。
【注意：根据细胞壁结构的不同，细菌可分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类；革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；如：金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌。革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素；如：大肠杆菌】
③绝大多数微生物与传染病无关，90%以上的微生物是对人类有利的。
2.培养基配置
①微生物的生命活动需要五大营养要素：
水、无机盐、碳源、氮源、生长因子；
②有的物质既是碳源又是氮源（为微生物生长提供碳元素和氮元素），如：蛋白质、蛋白胨；
③有的既是碳源又是生长因子（是微生物生长不可缺少的微量有机物），如：酵母提取物；
④“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌喜37℃的温度；霉菌喜25-30℃的温度；
⑤细菌的培养基：蛋白胨、酵母提取物、一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压；通常在中性偏碱的环境中生长；
⑥霉菌的培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可；通常在中性偏酸的环境中生长；
⑦在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要适宜的pH、温度以及特殊营养物质，以满足微生物生长对的要求。
3.培养基的种类及用途：
①液体培养基：呈现液态，用于扩大培养和工业生产；
②固体培养基：配制时需加入琼脂（凝固剂），呈固态，用于菌种分离、鉴定、计数等；
③我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，用LB固体培养基来分离大肠杆菌。
4.灭菌和消毒（重点内容）
①无菌技术：人们利用微生物完成一定的反应，必须要求某种微生物是没有被其他微生物污染的，因此，在培养微生物时必须进行无菌操作；
②灭菌是用物理或化学的方法，杀死或除去环境中的一切微生物的方法。杀死病原菌的方法叫消毒。如：实验室要对使用前和使用后的培养基、各种容器进行灭菌；要对实验服、对病人的排泄物和衣物进行消毒。
③干热灭菌法：是利用火焰将接种环和试管上的微生物烧死（又称灼烧灭菌法），或在140-160℃的烘箱中加热2-3h，将微生物的营养体和芽孢杀死。【注意：干热灭菌法只适用于金属或玻璃用具】
④加压蒸气灭菌法（高压蒸气灭菌法）：这是生产和实验室常用的灭菌法，将灭菌锅内通入压力达到1000g/cm2的高压蒸气，锅内温度达121℃，持续15-30min，即可达到灭菌目的；
注意：当培养基内有葡萄糖时，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。⑤过滤灭菌法：有些化合物（尿素、碳酸氢钠等）加热会分解，如培养基中需要时，只能配成溶液单独过滤灭菌；通常用G6玻璃砂漏斗过滤。其他型号（如：G1-G5）的不能除菌。
【注意：玻璃砂漏斗使用方法：使用前也要用高压蒸汽灭菌，玻璃砂漏斗有6种型号，即G1-G6，G6孔径最小，细菌不能滤过，在使用后需要用
1mol/L
的
HCl
浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液至中性，干燥后保存】
⑥紫外线光灭菌法：紫外光谱范围是100-400nm，灭菌最有效的波长为253.7nm，它是DNA的吸收区，可使菌体的蛋白质和核酸变性，芽孢可在10min内杀死。注意：紫外线对人的皮肤、眼睛等会造成伤害，开启紫外线灯后，人必须离开。
5.灭菌操作：
①各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子等等，这些用具通常用高压蒸汽灭菌法灭菌：
试管需加棉花塞或塑料盖；三角瓶可用封口膜或6层纱布封口；移液管上端用镊子放入少量棉花；取样器的“枪头”放在可灭菌的专用塑料盒中；
b.各种用品均用牛皮纸或报纸包好；
c.在121℃（1000g/cm2压力）下灭菌15-30min；
d.将实验用具放入60-80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分；
e.在进行实验操作前，将需要使用的用具从烘箱中取出，放到超净台上，然后打开紫外线灯和过滤风，灭菌30min。
②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法灭菌，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；
③对不能受潮的实验器具使用干热灭菌法。
注意事项：
①实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。灭菌后，通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的水分；
②在将培养基加到三角瓶、试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、培养皿壁上不能沾有培养基，否则容易发生污染；因此，在将培养基转移到三角瓶或试管中时，必须用三角漏斗；向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要沾在壁上；
③在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作；
④接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；
7.细菌的培养和分离
①接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养物，放到新的培养基中；
【注意a.取菌种前，灼烧接种环的目：消灭接种环上的微生物；
b.除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环，目的是：消灭接种环上残留菌种；
c.取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；
d.实验结束后灼烧接种环的目的：防止细菌污染环境和操作者】
②（划线分离法）用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分的细菌间距离加大。将接种后的固体培养基培养10～20h后，一个细菌细胞就会繁殖成许多个细菌细胞，紧紧聚集在一起，形成单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面【将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌后将试管斜放，令其冷却，固体培养基即成为斜面】上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这样的方法也可以用于分离细菌，将污染的杂菌除去，这是划线分离法。
③（涂布分离法）先将培养的菌液稀释，通常稀释10-5～10-7倍，取
0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。
【注意：使用玻璃刮刀或镊子时，把从70%酒精中取出的刀或镊子放在火焰上使酒精燃烧，但不要在火焰上加热，酒精燃尽后即可使用】
④划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开
，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。
8.操作步骤：
①灭菌：在两个250mL的三角瓶中分别装入50mL
LB液体培养基和50mL
LB固体培养基，加上封口膜，将培养基用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1000g/cm2压力灭菌15min。
②倒平板：灭菌后，待高压锅或灭菌压力与大气压相同时（即没有压力了）打开锅盖。将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开超净台上的紫外线灯和过滤风【注意：打开紫外线灯后人必须离开】，待固体培养基冷却到60℃时，关闭紫外线灯，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。在酒精灯火焰旁，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里，将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待凝固后即形成平面。
③接种培养：将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，接种前，应先使接种环接触培养基以达到冷却的目的，然后再取菌体，将菌体放入三角瓶的液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
④划线分离：在酒精灯上灼烧接种环，将摇床上培养了12h的菌液打开，接种环冷却后深入到菌液中，醮取菌液，在固体培养基的平板上连续划线，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿。最后，将培养皿倒置（盖在下面），在37℃恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
【注意：接种后，培养皿必须倒放在恒温培养箱中；因为正放时，水分形成的水滴会落入培养基表面，水流扩散会使菌落的菌体扩散，很难形成单菌落，就失去了分离菌株的效果；】
⑤保存菌种：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
⑥完成实验后：所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境；使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。
实验2：分离以尿素为氮源的微生物
【教材解读】
1.脲或称尿素，是蛋白质降解的产物；土壤环境中有一些细菌含有脲酶
，它们可以通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素分解的化学方程式为：
配制培养基：
①全营养LB固体培养基：蛋白胨（碳源和氮源）、酵母提取物（碳源和生长因子）、NaCl（无机盐，调节渗透压）、水、琼脂糖（去氮纯化后的凝固剂），加上封口膜后高压蒸汽灭菌后待用；
【注意：配制固体培养基时要添加适量琼脂糖，而不使用琼脂，是为了防止琼脂中的含氮化合物被细菌利用，尽量做到培养基中只有尿素一种含氮化合物，有利于以尿素为氮源的细菌的筛选】
②尿素固体培养基：葡萄糖（碳源）、NaCl（调节渗透压）、K2HPO4（无机盐）、水、琼脂糖和酚红（指示剂），加上封口膜后高压蒸汽灭菌后待用；待冷却至60℃时，加入通过G6玻璃砂漏斗过滤（过滤灭菌法）的10mL尿素溶液，摇动混合均匀待用。
操作步骤：
①倒平板：在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固；
②制备细菌悬液：在无菌条件下，将1g土样加到99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液，依此法制备10-3、10-4和10-5土壤稀释液（系列梯度稀释法）。取样时尽量只取悬液，摇匀后放在试管架上。
③用涂布分离法分离细菌：取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上【注意：不能在酒精灯上加热】，待刮刀上的火焰熄灭时，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
④将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24-48h，观察菌落。
⑤观察结果：全营养培养基中有较多菌落，而尿素为氮源的培养基中只有少量菌落。【原因：能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数量】。
⑥指示剂颜色：有脲酶的细菌菌落周围会出现红色的环带；【原因：脲酶使尿素分解后产生氨，呈碱性，遇酚红变红色；红色环带出现标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源；红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少】
实验
4：果汁中的果胶和果胶酶
【教材解读】
1.果胶是植物细胞壁的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是果胶的作用，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。
2.果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法；即：添加乙醇可以使果胶析出。
3.果胶可被果胶酶和果胶甲酯酶水解【注意：果胶酶不是一种，而是一类】；果胶水解的最终产物是半乳糖醛酸【注意：果汁中有果胶，果胶减少了水果组织的分散度，所以制作果汁时使用果胶酶可使果汁变澄清，提高出汁率】。
4.一般用于生产果胶酶的微生物有黑曲霉和苹果青霉，微生物中提取的果胶酶包含果胶酶和果胶甲酯酶。
5.实验操作及结果
6.果汁品质好的标准（了解）：
①尽量保留水果中的营养成分；②具有水果的原始口味；③有更多的固形物；④分散程度好，不沉淀，不上浮；⑤有原始的色彩；⑥除去所有的机械组织，更易消化。【注意：能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的条件就是最佳条件】
7.制作果汁加入果胶酶可将细胞离析，增加固形物的分散度；此外，还降低了水果匀浆悬液的黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。
8.果胶酶除用于制备果汁外，还用于果酒澄清，同时也作为洗衣粉的添加剂，加果胶酶的洗衣粉可除去衣服上的果汁、果酱等污垢。
实验
6：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
【教材解读】
1.固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法（了解：利用物理或离子交换的方法，将酶蛋白分子吸附在惰性载体上）、共价偶联法（了解：在温和条件下将酶蛋白分子与载体共价结合）、交联法（了解：以载体将酶蛋白分子相连）
、包埋法（将酶蛋白分子包埋在凝胶交联后的“格子”中）等。
2.固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地贮存和使用；可反复使用，更经济，更利于工厂化生产。3.淀粉酶是一类能水解淀粉的复合酶；本实验是用石英砂为吸附剂，将α淀粉酶（淀粉酶中的一种）固定在石英砂上，再将固定化酶装柱；一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精；用淀粉指示剂（常用KI-I2溶液）测试，流出物呈红色。淀粉的水解产物不同，显色也不同。完成下列填空：
4.使用的α淀粉酶通常是由枯草杆菌深层发酵制备，具有较强的液化淀粉的能力，可用于制备糊精，其最适PH为5.5-7.5，最适温度为50-75℃；
5.实验操作流程
①α-淀粉酶固定化：在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4mL蒸馏水中，由于酶不纯，可能会有些不溶物；再中入5g石英砂，不时搅拌，30min后装入一支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中；用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1mL/min。
②检验固定化酶柱的流出液中是否有淀粉酶：
a.取2支洁净的试管，编号为
A、B，各加入1mL可溶性淀粉溶液；
b.A试管中加入5滴淀粉酶柱的流出液，B试管中加入等量的蒸馏水，混合后60℃水浴保温5min（或用手握住试管增加温度）；
c.向AB试管各滴加2滴KI－I2指示剂，观察溶液颜色变化；
d.若AB试管溶液均为蓝色且颜色相同，则流出液中没有淀粉酶。
③用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱【目的：流速慢是为了保证酶和底物反应所需时间】，在流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液，加入1-2滴KI－I2溶液，观察颜色；用水稀释1倍后再观察颜色；
④实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱【目的：洗去固定化酶柱上残留的淀粉溶液及产物】，放置在4℃冰箱中，几天后再重复上述实验，看是否有相同结果。
☆如何测定木瓜蛋白酶亲和柱水解蛋白质？
用滴管分别取等量的蛋白质样液（对照组）和木瓜蛋白酶亲和柱流出液（实验组），加入A、B两支试管中；
向A、B两支试管分别滴加等量的双缩脲试剂，振荡均匀，观察颜色变化；
B试管中的颜色与A试管中的颜色有变化【了解：颜色深浅与肽键浓度成正比】，说明木瓜蛋白酶亲和柱的酶水解了蛋白质【原理：蛋白质被蛋白酶水解后肽键减少，用双缩脲反应测定肽键减少而发生的颜色变化，即可了解酶的水解作用】
实验
8：果酒及果醋的制作
【教材解读】
果酒的制作
1．与酒制作有关的微生物是酵母菌（了解：酵母在自然界分布广泛，已知有几百种之多），菌种的不同，所产生的酒的风味也不同。
2．葡萄酒是酵母利用葡萄糖进行酒精发酵（乙醇发酵）的产物，酵母菌只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，即将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇的浓度超过16%时，酵母菌就会死亡。
3.实验流程：
①冲洗和榨汁：将成熟的紫葡萄先用水洗净，再在鲜红紫色的高锰酸钾溶液【目的：是为了防止杂菌污染，但是，也消灭了葡萄果实上存在的野生酵母】，中浸泡约5min，然后用清水冲洗；沥去水后，将葡萄打成浆状【注意：尽量别把葡萄籽打碎，否则会影响葡萄酒风味】；
【注意：清洗葡萄时，应先清洗后去残枝；若不加酵母菌自然发酵时，不能多次清洗，防止果实上的野生酵母流失】
②配制酵母液：将适量干酵母放在一小烧杯中，加入少量温水（＜40℃），使干酵母成为糊状；为使酵母迅速发生作用，可加极少量蔗糖，混匀，放置片刻，待酵母悬液中出现气泡即可；
③装瓶：将葡萄浆放入发酵瓶中，装置不要超过容积的2/3【原因：酒精发酵有气体产生，装满容器会导致发酵液外溢，造成发酵液损失；也会造成瓶口等处被杂菌污染，影响产物品质】，然后加入酵母悬液【原因：使酵母菌成为优势菌群，抑制杂菌生长，防止出现异味影响质量；同时加速反应，观察现象更直观】，搅拌均匀，瓶上加一软木塞或橡胶塞，塞上有孔，孔中插一有弯曲的装有水的玻璃管【目的：a.隔绝空气，保持无氧环境；
b.排出产生的CO2，减少瓶内压力；
c.防止空气中的杂菌污染】。
④将装配好的发酵瓶放在25-30℃的条件下2-3天；当发酵瓶中停止出现气泡，即表示发酵完毕。若温度偏低，发酵时间相对延长；若温度高于30℃，要采取降温措施，否则酒的风味不佳。
⑤发酵完毕，将发酵液过滤、除去皮和籽；
⑥将获得的滤液分装到细口瓶中，加盖密封，静置，待沉淀后，上清液即为葡萄酒。
用纯葡萄制作的葡萄酒不含糖时（俗称“干红”或“干白”），酒精含量也低（平均的体积分数为8%）。若要制作酒精含量和糖含量都较高的果酒，则发酵液中应该加入一定的蔗糖。
用果汁制作果酒：
①制取果汁；
②向发酵瓶中加入蔗糖，然后倒入果汁；转动发酵瓶，使蔗糖完全溶解，最后倒入酵母悬液，混匀，加盖；
③3天后可看到气泡冒出，10天后剧烈的发酵停止，此时即可取出果酒过滤和分装；
④发酵开始时，微生物的有氧呼吸会使发酵瓶内出现负压【原因：有氧呼吸消耗容器内的氧气，产生的CO2溶解到溶液中，导致气体总量减少】；
⑤静置5-6个月后，酵母下沉，上清液即为果酒，可用虹吸法取出。
果醋的制作
1．与醋制作有关的微生物是醋化醋杆菌，菌种的不同，所产生的醋的风味也不同；培养醋化醋杆菌的液体培养基配方：蛋白胨、酵母提取物、甘露醇（碳源）。
2．醋杆菌只有在有氧条件下，才能将乙醇氧化为醋酸。用醋杆菌发酵，培养液中醋酸含量可以达到13%。
3.流程：
①如图连接发酵装置，将活塞关闭，把800mL酒-水混合物倒入甲瓶中，用铝箔将上口盖住；
②加入醋化醋杆菌：乙瓶是发酵瓶，醋酸发酵在其中进行；乙瓶内装锯末至八分满，乙瓶下口有两个孔，其中一个连接丙瓶，下面接一段胶管，通过胶管上的螺丝夹控制发酵液流出的速率；另一个孔插入一直角玻璃管，管内塞棉球，不要塞太紧，用以过滤空气【目的：防止空气中的杂菌进入】。此管另一端上升至锯末之上；
③发酵并检测
pH
值：将适量醋化醋杆菌的培养物或醋曲悬液加在200mL酒-水混合物中混匀，并调PH至7后倒入乙瓶中，使锯末均匀湿透，醋化醋杆菌附着在锯末上，此瓶中几乎没有游离的液体存在；
④通气发酵：将水族箱通气泵的出气管与乙瓶上的通气管连接，通气不必过快，使醋酸发酵48h后，用PH试纸检查乙瓶中流出液的PH，若检测结果显酸性，则可进入下一步。
⑤调节活塞控制流速，以保证反应充分进行；
⑥每天用PH试纸检测流出液的PH，监控发酵进行的情况，等到流出液的PH不再减少，或甲瓶中的液体全部注入乙瓶时，停止实验。
实验
10：泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
【教材解读】
泡菜的腌制
1．泡菜腌制过程中起作用的微生物主要是乳酸菌和假丝酵母。在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他的营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类等物质，但也含有一定量的对人体有害的致癌物质――亚硝酸盐；【需氧发酵产物：乙酸、亚硝酸盐等；无氧发酵产物：醇类、乳酸等】
2.在一定的发酵时间内，泡菜酸度适口，时间过长，则霉菌生长过多产生霉变味；
3.制作泡菜需要无氧环境，市场上有专用于制作泡菜的容器，它的口有一凹槽，对凹槽加水后再加盖，可造成无氧条件。
4.流程
①各种菜洗净、切块；
②泡菜坛洗净、消毒；
③将各种蔬菜、盐水【作用：抑制杂菌和调味】、糖及调味品放入坛，混合均匀；如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1min【目的：杀死蔬菜表面杂菌，降低蔬菜中的氧含量，利于进行无氧呼吸】后入坛，再加上一些白酒【作用：抑制泡菜表面杂菌的生长，同时可起到调味作用，增加醇香感】；
④将坛口用水封好，防止外界空气进入【不封口，会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂】；
⑤腌制1周左右即可开坛食用，也可以随时加入新鲜蔬菜，不断取用；
⑥如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。
5.出现异常：泡菜水上出现一层白膜，这是因为坛沿水槽的水干了，氧气进入泡菜坛，假丝酵母大量繁殖形成的菌膜；
6.亚硝酸盐含量变化：通常认为，亚硝酸盐是由需氧菌、假丝酵母产生的；整个过程中，亚硝酸盐含量变化是：先增加后减少；
亚硝酸盐的定量测定
1.亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与
N-1－萘基乙二胺偶联形成紫红色产物，可用光电比色法定量。
2.流程：
①样品处理：腌制的泡菜25g及少量泡菜汤，在匀浆机打成匀浆，用滤纸和三角漏斗滤至500mL烧杯中，用100mL水洗涤匀浆机和残渣两次，每次均过滤如上，合并滤液，用氢氧化钠溶液将PH调至8，再加入25mL硫酸锌溶液；摇匀，如不产生白色沉淀，再加入氢氧化钠至产生白色沉淀为止【目的：吸附滤液中的残渣和蛋白质等，使滤液澄清，利于显色反应】。在水浴中加热至60℃，10min后，令其冷却至室温，然后用滤纸过滤，用少量水淋洗沉淀2-3次，将滤液和洗涤液在500mL容量瓶中定容【注意：洗涤匀浆机、残渣、沉淀物的目的是减少样品中亚硝酸盐的流失】。
②测定样品的光密度值:取10mL样品溶液，加入4.5mL氯化铵缓冲液、2.5mL60%乙酸溶液和5mL显色液，定容于25mL的容量瓶中。混合均匀，暗处静置25min，用光程为1cm比色杯【比色杯是用来盛装所分析的样品液的容器，如图；光程是指单色光穿过比色杯中样品液的距离，即比色杯两侧内壁之间的距离】在550nm【原理：波长为550nm单色光通过比色杯（或比色皿）时，被里面的亚硝酸盐吸收掉一部分，然后照射在光电检测器上。光电检测器将光信号的强弱转变为电信号的大小，最后经放大，由显示部件显示出测量结果——光密度值】处测定光密度值（OD值）。以10mL水为空白对照。
③绘制标准曲线：取0、0.5、1.0、3.0和5.0mL亚硝酸钠标准溶液，分别放在25mL容量瓶中，各加入4.5mL氯化铵缓冲液、2.5mL60%乙酸溶液和5mL显色液，加水定容，混合均匀，暗处静置25min，用光程为1cm比色杯在550nm处测定光密度值（OD值）；以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
④根据曲线所得数据，计算每公斤样品中亚硝酸盐的含量（X）：
V2
=测定样品液体积（10mL）；V1
=样品处理液总体积（500mL）
m2
=通过标准曲线得到的亚硝酸盐的质量，
m1
=
样品质量（25g）
实验11
植物的组织培养
【教材解读】
组织培养就是取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在无菌的条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。【植物组织培养有两种形式，一种是愈伤组织培养，需用琼脂培养基；一种是细胞悬浮培养，需用液体培养基】
在培养基中必须加入生长素和细胞分裂素，两者的摩尔浓度比决定组织是生根，还是生芽。细胞分裂素与生长素的比例高时，诱导芽的生长；两者比例大致相等时，愈伤组织继续生长而不分化；两者比例低时，才会趋于生根。【记忆办法：“生根”“分芽”，即“生长素”所占比例高时生根，细胞分裂素所占比例高时生芽】
菊花组织培养过程：首先用细胞分裂素相对较多和生长素相对较少的培养基（发芽培养基）进行培养，使长出较多的丛状苗；然后将丛状苗分株培养【解析：将植物的根、茎基部长出的小分枝与母株相连的地方切断，然后分别培养】。分株后，再移入含有较多生长素的培养基（生根培养基）中，使其生根；将生根的苗从三角瓶中移至草炭土或蛭石中继续生长；苗健壮后再移至土中。
MS培养基：由大量元素、微量元素和有机成分组成；
萘乙酸【NAA，人工合成的生长素类似物】需用少量氢氧化钠溶液溶解，苄基腺嘌呤【BA，人工合成的细胞分裂素类似物】需用少量盐酸溶解。
发芽培养基:3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖（除作为营养成分外，还具有调节渗透压的作用）+40g琼脂（用做制作固体培养基的凝固剂）；生根培养基：1000mLMS培养基+0.38mgNAA溶液+30g蔗糖+20g琼脂。
操作步骤：
①在超净台中，取出一瓶已进行过无菌培养的菊花幼苗，在无菌培养皿上用无菌镊子和无菌解剖刀切成几段，每段至少有一张叶片。
②在酒精灯旁，将每段放入1瓶生芽培养基中，使茎的一部分插入培养基内，盖上封口膜，每瓶也可放入2-3段幼茎切段。
③在日光下保持18-25℃的温度培养，每天的光照不少于14.5h。
④2-3周后将生长健壮的丛状苗在无菌条件下转入生根培养基中，在上述条件下继续培养。
⑤待生根后，将苗移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上的湿度，2-3天后打开玻璃罩逐渐降低湿度进行锻炼，直到将罩全部打开处于自然湿度下为止。
⑥再转移至土中培养（定植），即可长成植株并开花。
⑦若使用自然生长的茎进行组织培养，则可取一段茎在70%乙醇中浸泡10min，再放入5%次氯酸钠溶液中浸泡5min，然后用另一5%次氯酸钠溶液浸泡5min，最后在超净台中用无菌水清洗，将茎的切段培养在生芽培养基中。【注意：先发芽后生根】
【补充：天然激素在植物体内作用和存在的时间较短，是因为植物体内存在使之分解的酶；而不存在分解人工合成激素的酶，所以人工合成激素的作用时间长，作用效果明显】
选修1
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