资源简介

选修一　生物技术实践
第一讲　传统发酵技术的应用
,考纲要求)1.运用发酵加工食品的基本方法　Ⅱ
2．利用微生物进行发酵来生产特定的产物及微生物在其他方面的应用　Ⅱ
3．微生物技术在食品加工方面的应用　Ⅱ
考点一　果酒和果醋的制作
,　)
1．发酵菌种
(1)图中A可表示酒精发酵菌种的细胞模式图，该菌种主要来自附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
(2)图中B可表示醋酸发酵菌种的细胞模式图，该菌种可从变酸的酒的表面的菌膜获取。
2．果酒和果醋的制作
果酒制作 果醋制作
制作原理 菌种 酵母菌 醋酸菌
反应 有氧条件下，大量繁殖：C6H12O6＋6O26CO2＋6H2O＋大量能量 无氧条件下，酒精发酵：C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋少量能量 氧气、糖源充足时：C6H12O6＋2O22CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋少量能量 缺少糖源、氧气充足时：C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋少量能量
发酵条件 温度 一般酒精发酵18℃～25℃，繁殖最适为20℃左右 最适为30℃～35℃
空气 前期：需氧；后期：不需氧 需要充足的氧气
时间 10 d～12 d 7 d～8 d
3.制作流程
4．葡萄酒呈现深红色的原因是红葡萄皮的色素进入发酵液。
5．现在工厂生产果酒，为提高果酒的品质，更好地抑制其他微生物的生长，采取的措施是直接在果汁中加入人工培养的酵母菌。
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易错整合，判断正误。
(1)醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生醋酸(　×　)
(2)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度(　×　)
(3)在果酒发酵后期拧开瓶盖的间隔时间可延长(　√　)
(4)在家庭中用新鲜葡萄制作果酒时，需给发酵装置适时排气(　√　)
(5)在制作果酒、果醋时，适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖(　√　)
(6)利用葡萄发酵产生果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸(　×　)
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　如图为果酒和果醋制作的实验装置图，据图分析：
(1)甲、乙、丙的作用分别是什么？
(2)图中发酵瓶中葡萄汁的量是否恰当？为什么？
(3)醋酸菌进行醋酸发酵时，无论是利用糖源还是酒精，甲都需要打开，请说明原因。
(4)果酒搁置时间过久为什么会有酸味？
[提示](1)通入空气(氧气)、排气、取样(对发酵的情况进行及时的监测)。
(2)不恰当，因为葡萄汁的量不能超过发酵瓶体积的2/3，而且不能将排气口淹没。
(3)醋酸菌是需氧菌，在发酵过程中始终需要氧气，如果氧气中断则会引起醋酸菌的死亡。
(4)醋酸菌在缺乏糖源时，可以将酒精转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸。
重 难 精 讲
1．果酒和果醋制作步骤的比较
制果酒 制果醋
相同 过程 ①选材和材料处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物后，再去枝梗 ②制作发酵液，防止杂菌污染 ③发酵：将葡萄汁注入发酵瓶，注意液体量不要超过发酵瓶总体积的2/3
不同 过程 ④将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12 d左右。发酵旺盛期的CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂 ⑤检测指标：7～10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以嗅味和品尝、用重铬酸钾检验酒精含量，进行酵母菌的镜检、测定pH等工作 ④将温度严格控制在30～35℃，并注意适时通过充气口充气 ⑤检测指标：果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH进一步鉴定。还可以在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴定
2.制作果酒和果醋的发酵装置分析
(1)各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管，可有效阻止空气中微生物的进入，避免来自空气的污染。
③出料口：用来取样。
(2)该装置的使用方法：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口，制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。
精 准 命 题
例1　(2018·广西南宁毕业班摸底联考)自古以来，人们就利用发酵技术来生产各种产品。回答问题：
(1)果酒和果醋的制作依次利用了酵母菌和醋酸菌两种微生物，两者在结构上的根本区别是后者无由核膜包被的细胞核；若从自然菌样中筛选较理想的菌种进行纯化培养，通常采用平板划线(或“稀释涂布平板”)法接种。
(2)在果酒制作过程中，发酵装置需先通气然后进行密封处理，发酵过程中还要定时排气，其中通气的目的是让酵母菌进行大量繁殖，密封的目的是为酵母菌发酵提供无氧环境。
(3)在果酒的基础上制作果醋时，菌种在无糖和氧气充足的条件下能将乙醇变为乙醛，再变为醋酸。检验生产出的果醋中是否含有酒精的方法是用酸性条件下的重铬酸钾检验，观察是否出现灰绿色。
[解析]　(1)果酒制作利用的是酵母菌，果醋制作利用的是醋酸菌。酵母菌为真核生物，醋酸菌为原核生物，二者在结构上的根本区别是醋酸菌无由核膜包被的细胞核。纯化菌种可以采用稀释涂布平板法或平板划线法接种。(2)果酒的制作过程中，发酵装置需先通气是为了让酵母菌进行有氧呼吸并大量繁殖，密封的目的是为酵母菌进行酒精发酵提供无氧环境。(3)醋酸菌在无糖和氧气充足的条件下能将乙醇变为乙醛，再氧化为醋酸。检验酒精可用酸性重铬酸钾溶液，若出现灰绿色现象则说明含有酒精。
〔对应训练〕
1．(2016·全国卷Ⅱ，39)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的，回答下列问题：
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的细胞质基质中进行，其产物乙醇与重铬酸钾试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的线粒体中进行，与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度快。
(2)第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在有氧条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度低于(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸杆菌属于原核生物，其细胞结构中不含有(填“含有”或“不含有”)线粒体。
[解析]　(1)酵母菌有氧呼吸第一阶段及无氧呼吸全过程都在细胞质基质中进行；酒精与酸性重铬酸钾试剂反应呈灰绿色。图示过程③为细胞有氧呼吸第二、三阶段，在线粒体中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度快。(2)醋酸杆菌的呼吸作用类型为有氧呼吸，所以将乙醇转变为醋酸的过程需在有氧条件下进行。(3)酒精发酵时一般将温度控制在18～25℃，醋酸发酵时一般将温度控制在30～35℃，故在生产过程中，酒精发酵温度低于醋酸发酵温度。(4)醋酸杆菌属于原核生物，其细胞结构中不含有线粒体。
考点二　腐乳和泡菜的制作
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1．腐乳的制作
(1)腐乳制作的原理
①菌种：多种微生物(如青霉、酵母、曲霉、毛霉等)的协同作用，起主要作用的是毛霉。
②菌种作用特点：产生蛋白酶、脂肪酶，分解有机物。
蛋白质氨基酸＋小分子的肽。
脂肪甘油＋脂肪酸。
(2)制作流程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
(3)影响条件
①温度：控制在15℃～18℃。
②菌种的来源：空气中的毛霉孢子或优良毛霉菌种。
③卤汤配制
a．卤汤的成分：酒及各种香辛料。
b．酒的作用：抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味。
c．香辛料的作用：调制腐乳的风味，防腐杀菌。
④材料的用量
a．控制盐的用量：浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；浓度过高，会影响腐乳的口味；
b．酒的含量：应控制在12%左右。
2．制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
(1)泡菜制作
①原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。反应式：C6H12O62C3H6O3＋少量能量。
②制作流程
③操作关键
a．泡菜坛的选择：应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
b．腌制的条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。防止杂菌污染，严格密封。
(2)据几种发酵食品制作方法填空
表中甲～丁为腐乳、泡菜、果醋、果酒等发酵食品制作装置图，回答下列问题：
食品 ① ② ③ ④
主要 微生物 ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
制作 装置
a.请填出①～④食品名称：①：果酒，②：果醋，③：腐乳，④：泡菜。
b．请填出⑤～⑧菌种名称：⑤：酵母菌，⑥：醋酸菌，⑦：毛霉，⑧：乳酸菌，其中酵母菌、毛霉为真核生物，醋酸菌、乳酸菌为原核生物。
,　　)
易错整合，判断正误。
(1)泡菜制作的菌种主要是醋酸菌(　×　)
(2)制作泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用(　×　)
(3)泡菜坛的选择、发酵过程中坛沿要注满水都有利于泡菜的无氧发酵(　√　)
(4)将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量(　×　)
(5)在腐乳制作过程中加入香辛料既能调节风味，还具有防腐杀菌作用(　√　)
(6)在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右(　√　)
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　下图是泡菜在腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化规律，据图分析：
(1)从生物间的相互关系和条件变化分析，乳酸菌呈现这种变化规律的原因是什么？
(2)乳酸含量开始很低，中后期急剧增加的原因是什么？
(3)分析亚硝酸盐的含量变化的原因。
[提示](1)发酵初期以不产酸的大肠杆菌和酵母菌的活动为主，同时还有一部分硝酸盐还原菌在该时期利用氧气，产生了无氧环境，乳酸菌开始活动；发酵中期由于乳酸菌产生了大量乳酸，其他细菌活动受到抑制，乳酸菌活动增强；发酵后期由于乳酸的积累，酸度继续增长，乳酸菌活动也受到抑制，乳酸菌数量下降。
(2)发酵初期有氧气，乳酸菌活动较弱，中后期氧气含量减少，乳酸菌大量繁殖，乳酸的量迅速积累。
(3)发酵初期，乳酸菌和乳酸的量都比较少，而由于硝酸盐还原菌的活动，亚硝酸盐含量逐渐增加；后期由于硝酸盐还原菌受抑制，同时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降。
重 难 精 讲
1．影响腐乳品质的条件
项目 说明
水的控制 含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形
盐的控制 盐浓度过高会影响腐乳的口味；盐浓度过低，腐乳易腐败变质
酒的控制 酒精含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，杂菌繁殖快，豆腐易腐败
温度控制 温度为15～18℃，适合毛霉生长
发酵时间 控制在6个月左右
香辛料 具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳的风味或质量
2.腐乳制作的注意事项
(1)用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。
(2)装瓶腌制时，操作要迅速小心，且要逐层加盐，离瓶口表面的盐要铺厚一些。
(3)加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
[易错警示]
传统腐乳制作与现代腐乳生产的区别
(1)条件要求：传统腐乳制作不需要灭菌，现代腐乳生产必须在严格无菌条件下进行。
(2)菌种来源：传统腐乳制作，菌种来自空气中的毛霉孢子；现代腐乳生产，菌种是经过筛选的优良毛霉菌种，并且直接接种在豆腐上。
3．泡菜制作的注意事项
(1)材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4：1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
(3)氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
精 准 命 题
例2　(2018·海淀质检)通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出(　A　)
①大肠杆菌 ②霉菌
③放线菌 ④固氮细菌
A．④②③ B．①②③
C．①③④ D．只有③④
[解析]　缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。
归纳总结
“列表法”比较四种传统发酵产品的菌种与原理
食品 菌种 呼吸类型 原理 温度
果酒 酵母菌 兼性厌氧 无氧呼吸产生酒精 18～25℃
果醋 醋酸菌 需氧 糖(酒精)→醋酸 30～35℃
腐乳 毛霉等 需氧 蛋白酶、脂肪酶分 别水解蛋白质、 脂肪 15～18℃
泡菜 乳酸菌 无氧 无氧呼吸产生乳酸 －
〔对应训练〕
2．(2018·四川三台中学第二次月考)人们的日常生活与传统发酵技术密切相关。请回答下列相关问题：
(1)制作腐乳的过程中所用到的微生物主要是毛霉。
(2)在制作果醋、腐乳、泡菜的过程中需要提供氧气的是制作果醋和腐乳。在发酵产物制作过程中都需要培养微生物，为防止杂菌污染，需要对培养液(基)和培养器皿进行灭菌(填“消毒”或“灭菌”)。
(3)利用酵母菌酿酒时，一开始持续通入空气，导致酵母菌数量增多(填“增多”“不变”或“减少”)，然后再密封，使酒精增产(填“增产”“减产”或“不产生”)。
(4)在制作腐乳的过程中加盐的作用是析出豆腐中的水分使其变硬；_抑制微生物生长，避免豆腐块变质。
(5)在制作泡菜的过程中，要检测亚硝酸盐的含量。亚硝酸盐与某些化学物质发生反应后形成玫瑰红色染料。先将泡菜样品及一系列已知浓度的亚硝酸盐溶液分别与相应化学物质发生显色反应，再通过颜色的比对，可以估测出泡菜样品中亚硝酸盐的含量。
[解析]　(1)腐乳制作中发挥主要作用的微生物是毛霉。(2)制作果醋要用到醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动；制作腐乳主要用到毛霉，毛霉需要在有氧条件下生长；制作泡菜要用到乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下，把葡萄糖分解成乳酸。 在发酵产物制作过程中都需要培养微生物，为防止杂菌污染，需要对培养液(基)和培养器皿进行灭菌。 (3)酵母菌在有氧条件下能够繁殖，数量不断增多；在无氧的条件下，不再增殖，而是进行酒精发酵，产生酒精。 (4)制作腐乳的过程中加盐，可析出豆腐中的水分使其变硬，还能够抑制微生物生长，避免豆腐块变质。 (5)在制作泡菜的过程中，要检测亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐与某些化学物质发生反应后形成玫瑰红色染料。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．传统发酵技术的三个要点
(1)泡菜制作过程中乳酸含量先增加后保持稳定。
(2)制作果醋利用醋酸菌的有氧呼吸。
(3)腐乳制作中酒精及香辛料的作用不仅仅在于调味。酒精还可以抑制微生物生长，香辛料可防腐杀菌。
2．泡菜制作中盐水煮沸的两大作用
清水和盐的质量比为4：1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
3．几种发酵技术中的微生物种类
(1)在葡萄酒的自然发酵中，菌种来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
(2)腐乳制作的主要菌种是毛霉，其在15～18℃生长迅速。豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子。
(3)制作泡菜的主要菌种是乳酸菌(厌氧菌)，在无氧条件下可将葡萄糖分解为乳酸。
3．〔探究高考·明确考向〕
　(2017·全国卷Ⅱ，37)豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。为了研究影响豆豉发酵效果的因素，某小组将等量的甲、乙两菌种分别接入等量的A、B两桶煮熟大豆中并混匀，再将两者置于适宜条件下进行发酵，并在32h内定期取样观测发酵效果。回答下列问题：
(1)该实验的自变量是菌种、发酵时间。
(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是好氧菌。
(3)如果在实验后，发现32h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是延长发酵时间，观测发酵效果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间。
(4)从大豆到豆豉，大豆中的成分会发生一定的变化，其中，蛋白质转变为氨基酸和肽，脂肪转变为脂肪酸和甘油。
[解析]　(1)实验使用甲、乙两种菌种，并在32 h内定期取样观测发酵效果，所以该实验的自变量是菌种和发酵时间。(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是好氧型微生物。(3)如果在实验后，发现32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是延长取样观测时间，观测发酵结果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间。(4)从大豆到豆豉，在相关微生物的作用下，大豆中的蛋白质转变为肽和氨基酸，脂肪转变为甘油和脂肪酸。
第二讲　微生物的培养和应用
,考纲要求)1.微生物的分离和培养　Ⅱ
2．培养基对微生物的选择作用　Ⅱ
3．某种微生物数量的测定　Ⅱ
考点一　微生物的分离与培养
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1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。
2．无菌技术
(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)不同对象的无菌操作方法(连线)
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易错整合，判断正误。
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　√　)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　×　)
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　√　)
(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　×　)
(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(　√　)
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1．(教材选修1P16旁栏思考题)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌？如果需要，请选择合适的方法：
(1)培养细菌用的培养基与培养皿
(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管
(3)实验操作者的双手
[提示](1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。
2．(教材选修1P17“倒平板操作讨论”)(1)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
(2)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
[提示](1)通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(2)平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
重 难 精 讲
1．培养基配制
(1)培养基的成分
营养 物质 含义 作用 主要来源
碳源 能提供碳元素的物质 构成生物体的物质，异养生物的能源物质 无机物：CO2、NaHCO3； 有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等
氮源 能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物 无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐； 有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长 因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 细胞生命活动必不可少的物质 不仅是良好的溶剂，还是结构物质 培养基、大气、代谢产物
无机盐 提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂 培养基、大气
(2)培养基的分类
种类 特点 应用
物理 性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
半固体培养基 加凝固剂 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基 微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏
化学 成分 天然培养基 含化学成分不明的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确或用一定化学物质配制 分类、鉴定
用途 选择培养基 添加某物质，抑制杂菌生长，促进所需微生物生长 培养分离出特定微生物
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂 鉴别微生物
　(3)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备
计算 依据配方比例，计算配制不同体积的培养基时各种成分的用量
称量 准确称取各种成分。牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称取后及时盖上瓶盖
熔化 将称好的牛肉膏和称量纸一同放入烧杯，加入少量水，加热，取出称量纸，加入称量好的蛋白胨和氯化钠，加琼脂。在熔化时注意玻璃棒要不断地搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂，最后定容至100 mL
灭菌 灭菌前，调节pH；高压蒸汽灭菌
倒平板 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
[易错警示]
(1)培养基的配制原则
①目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等选择原料配制培养基，如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。
②营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。
(2)微生物对主要营养物质的需求特点
不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
2．纯化微生物的接种方法
(1)两种接种方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基上。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用 范围 适用于好氧菌 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
示意图
(2)平板划线操作的注意事项
①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作 每次划线之前 划线结束
目 的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
②灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
3．消毒和灭菌的辨析
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消 毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭 菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、 金属工具
高压蒸汽 灭菌法 培养基及容 器的灭菌
精 准 命 题
例1　(2018·广东广州毕业班模拟)某同学配制含琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基后，对培养基和培养皿进行高压蒸汽灭菌，当培养基温度下降到50 ℃时，在酒精灯火焰附近倒平板，待培养基冷却至室温，按下表处理：
组别 处理
A组 打开培养皿盖，距地面0.3米处暴露15分钟
B组 打开培养皿盖，距地面0.6米处暴露15分钟
C组 打开培养皿盖，距地面0.9米处暴露15分钟
D组 打开培养皿盖，距地面1.2米处暴露15分钟
E组 不打开培养皿盖
将处理完毕的培养皿置于适宜温度下培养2～3天，观察每个培养皿中的菌落特征和数目。回答下列问题：
(1)上述实验的实验目的是探究不同高度空气中微生物的种类和数量。若E组的培养基表面有菌落生长，说明培养基灭菌不合格(受到杂菌污染)。
(2)培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为微生物生长提供碳源和氮源。“在酒精灯火焰附近”进行相关操作是为了避免周围环境中微生物的污染。
(3)实验过程特别强调温度控制，请简要说明下列温控措施的目的：
①“待培养基冷却至室温”的目的有使培养基凝固，并防止培养基温度过高杀死接种在其上的微生物。
②“将处理完毕的培养皿置于适宜温度下培养”的目的是让细菌在适宜的温度下生长(繁殖)。
(4)培养微生物时将培养皿倒置的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)。实验结束后，对使用过的培养基应进行灭菌处理。
技巧点拨
正确判断培养基制作与接种操作是否合格的方法
(1)从培养基制作是否合格上判断：如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
(2)从接种操作是否符合无菌要求上判断：
①如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合接种菌菌落的特点，说明接种操作是符合要求的；
②如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，重新操作。〔对应训练〕
1．(2018·江西南昌一模)下表为某微生物培养基的配方，请回答相关问题：
成分 含量 成分 含量
Na2HPO4 3 g 尿素 1.0 g
K2HPO4 1 g C6H12O6 30 g
MgSO4·7H2O 0.5 g 琼脂 15 g
FeSO4 0.01 g H2O 1 000 mL
NH4NO3 0.3 g
(1)按物理性质划分，该培养基属于固体培养基，无论配制何种培养基，在原料称量、溶解之后都要先调pH，然后分装、包扎并灭菌，常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。
(2)根据培养基的成分判断，该培养基能否用于分离土壤中分解尿素的细菌？不能，原因是培养基中含有NH4NO3，尿素不是唯一氮源。
(3)为检测尿素分解菌是否存在，还应加入酚红，如果存在，将出现红色反应。
(4)微生物常用的接种方法有平板划线法或稀释涂布平板法。
[解析]　(1)根据表格信息，该培养基含有琼脂，因此为固体培养基。配制培养基时原料溶解后要先调pH。对培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法。(2)若要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应作为唯一氮源，而表中除了尿素外，还有NH4NO3，因此一些不能分解利用尿素的细菌也能生长，无法达到只分离尿素分解菌的实验目的。(3)细菌合成的脲酶能将尿素分解为氨，使培养基呈碱性，因此在培养基中添加酚红指示剂，若有尿素分解菌，则在菌落的周围会出现红色环带。(4)接种微生物常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
2．微生物培养技术在医疗、工业生产等方面均有应用。烧伤病人容易感染绿脓杆菌，临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。请回答下列相关问题：
(1)适于绿脓杆菌生长的培养基中的营养成分一般含有碳源、氮源、水和无机盐，除了提供以上几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(2)若对绿脓杆菌进行分离计数，需要将含有绿脓杆菌的菌液采用稀释涂布平板法接种于固体培养基表面进行培养，这种接种方法的好处是可得到单个的菌落(或可将菌群分散成单个的细菌)。
(3)对培养基进行灭菌后，待培养基冷却至50℃时，需要在酒精灯火焰附近倒平板。接种时所用的接种环在接种前后都需要通过灼烧法灭菌。
(4)将分别含等剂量不同抗生素的相同大小的小滤纸圆片均匀置于该平板上的不同位置，在适宜条件下培养一段时间，结果滤纸片周围均出现透明圈，这说明绿脓杆菌对实验所用抗生素表现为敏感(填“敏感”或“不敏感”)。
3．(2016·全国卷Ⅰ，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配置培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于牛肉膏、蛋白胨。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是琼脂。
(2)步骤③中，实验组的操作是将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了污染现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法不正确(填“正确”或“不正确”)。
[解析]　(1)牛肉膏、蛋白胨都含有N，可为微生物的生长提供氮源。制作无菌平板所用培养基为固体培养基，因此X应为琼脂。(2)由实验目的可知，该实验的自变量为教室的不同高度，因变量为微生物的分布情况，故实验组的操作应为将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。(3)空白培养基上出现菌落，说明培养基被污染了，即调查中出现了污染现象。实验过程中若培养基被污染，必须将其抛弃，重新制作新的培养基进行实验。
考点二　微生物的筛选和计数
,　)
　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
,　　)
易错整合，判断正误。
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类
(　×　)
(2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(　√　)
(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(　√　)
(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(　×　)
,　　)
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数中设置对照实验的目的是什么，如何设置？
[提示]设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，例如为了排除培养基是否被杂菌污染，需以尿素为唯一氮源的培养基接种等量的无菌水作为空白对照。
2．为什么选择性培养基能够浓缩所需的微生物？
[提示]在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
重 难 精 讲
1．选择培养基的选择方法
(1)在培养基中加入某种化学物质：例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以分离出金黄色葡萄球菌。注意：这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分：例如，缺乏氮源时可分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时可分离出消除石油污染的微生物。
(3)改变微生物的培养条件：例如，将培养基置于高温环境中培养，可得到耐高温的微生物。
2．微生物的计数
(1)两种计数方法的比较
比较 项目 间接计数法 (稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数： (C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
(2)设置对照和重复
比较项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照：确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
3.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法：
①单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
②选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
③鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
(2)微生物的鉴别方法：
①菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
②指示剂鉴别法：如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。
③染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
[易错警示]
“选择菌落数在30～300的平板”的两个提醒
用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。解题时易出现以下误解：
(1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。
(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：
①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。
可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
精 准 命 题
例2　(2018·安徽示范高中联合质检)水中细菌总数可以作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1 mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，经37℃、24 h培养后，所生长出的细菌菌落数。为初步测定某处池水中的细菌数目，实验的大致流程为：水样采集→梯度稀释→接种培养→菌落计数。回答下列问题：
(1)对采集的池水进行梯度稀释时，应先将1 mL水样加入9_mL无菌水中以获得稀释10倍的稀释液。实验中对采集的池水要进行稀释的原因是避免池水中细菌数目过多(密度过大)，得不到单菌落。
(2)接种培养所用到的培养基中，能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是牛肉膏、蛋白胨。
(3)为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。用这种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(4)实验过程中为确保培养基上菌落来自所采集水样，避免杂菌污染。实验中具体操作有：采集水样的容器要灭菌，稀释和接种要在酒精灯火焰旁等(至少答两点)。
[解析]　(1)要获得稀释10倍的稀释液，可将采集的样本与无菌水按照1：9的比例混合即可。稀释的主要目的是便于计数，若采集的样本中细菌密度大，则难以计数，需要对样本进行稀释。(2)根据题干信息可知，实验所用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏、蛋白胨可同时为细菌提供碳源和氮源。(3)为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。在微生物培养过程中，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故用这种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。(4)细菌分布广泛，为了保证培养基上的菌落来自所采集水样，需要对采集的容器、接种环等进行灭菌，在接种过程中严格保证无菌环境。
〔对应训练〕
4．已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：
(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用萃取法(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。
(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以油脂为碳源的固体培养基进行培养。
(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用血细胞计数板直接计数；若要测定其活菌数量，可选用稀释涂布平板法进行计数。
(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，45℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕40℃设计后续实验。
[解析]　(1)油脂可被苏丹Ⅲ染液或者苏丹Ⅳ染液染成橘黄色或红色。由于不易挥发，故采用萃取法。(2)产生脂肪酶的微生物B可以分解脂肪，故可以以脂肪为碳源的固体培养基进行培养，不产生脂肪酶的微生物无法生存。(3)微生物B的菌体数，可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，测定活菌用稀释涂布平板法。(4)45 ℃降解10 g油脂所需酶量最大，故酶活性最小；40 ℃下降解10 g油脂所需酶量最小，故酶活性最大，所以要测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度进行后续实验。
5．(2016·四川卷，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以尿素为唯一氮源；鉴别培养基还需添加酚红作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成红色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是稀释涂布平板法，每克土壤样品中的细菌数量为1.75×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较少。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。
[解析]　(1)筛选产脲酶细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源；鉴别培养基还需要添加酚红作指示剂，产脲酶细菌产生的脲酶可以将尿素分解成氨，导致培养基的pH升高，菌落周围的指示剂将变成红色。(2)图中过程采取的接种方法是稀释涂布平板法，每克土壤样品中的细菌数量为：(156＋178＋191)/3÷0.1×105＝1.75×108，血细胞计数板计数法所得数据包括死的细菌，且稀释涂布平板法计数时所计菌落数少于真正的活细菌数，故与血细胞计数板计数法相比，此计数法测得的细菌数较少。(3)图乙从起始密码算起的碱基序列号为271，前270个碱基决定90个氨基酸，从271位到箭头处可以决定1个氨基酸，然后插入70个核苷酸，可决定23个氨基酸，多出一个碱基，加上后面的AG刚好可以决定1个氨基酸，则后面UGA是终止密码。因此突变基因转录的mRNA终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质所含氨基酸数为90＋1＋23＋1＝115(个)。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．纯化大肠杆菌两种方法的异同
(1)相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。
(2)不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。
2．辨析平板划线操作的三个易错点
(1)灼烧接种环之后，要冷却后再进行取种，以免温度太高杀死菌种。
(2)划线时最后一区域不要与第一区域相连。
(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2018·全国卷Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能破坏DNA结构。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过氯气(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是未将锅内冷空气排尽。
[解析]　(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。
(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。
(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。
(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。
(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
2．(2018·全国卷Ⅲ，37)回答下列与酵母菌有关的问题：
(1)分离培养酵母菌通常使用麦芽汁琼脂(填“牛肉膏蛋白胨” “MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进菌体快速增殖(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进乙醇产生(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软。
[解析]　(1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为酵母菌的繁殖提供能量，在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。
(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的CO2，CO2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。
3．(2018·江苏卷，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，及时对培养基进行分装，并进行高压蒸汽(湿热)灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约50_℃(在25 ℃、50 ℃或80 ℃ 中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有a、b、d__。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得高甲醇耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上无色细胞的个数应不少于30，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
[解析]　(1)配制培养基时，进行计算、称量、溶化后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。
(2)倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。
(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得耐受高甲醇的菌株，d正确。
(4)酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
4．(2017·全国卷Ⅰ，37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生脲酶。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定(答出两点即可)。
[解析]　(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基是只允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此，配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可以使培养基中pH保持相对稳定。
第三讲　生物技术在其他方面的应用
,考纲要求)1.从生物材料中提取某些特定的成分　Ⅱ
2．蛋白质的提取和分离技术　Ⅱ
考点一　蛋白质的提取和分离
,　)
1．血红蛋白的提取
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除杂蛋白。
②方法：采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复洗涤三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放
加蒸馏水(作用是使红细胞吸水涨破)到原血液的体积，再加40%体积的甲苯(作用是溶解细胞膜)，充分搅拌，细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液
①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。
②将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。
2．血红蛋白的粗分离——透析
(1)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
(3)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
3．血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
(1)原理：相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，路程较长，移动速度较慢而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。
(2)过程
①调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面平齐
↓
②滴加透析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1 mL样品加到色谱柱顶端
↓
③样品渗入凝胶床：加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
↓
④再调整缓冲液面：关闭下端出口，小心加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度
↓
⑤洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
↓
⑥收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
4．纯度鉴定——电泳
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
,　　)
易错整合，判断正误。
(1)透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同(　×　)
(2)通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质(　√　)
(3)不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质(　√　)
(4)影响泳动速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强度、溶液的pH等(　√　)
,　　)
　右图是用凝胶色谱法分离a、b两种蛋白质的示意图，请分析：
(1)先从层析柱中洗脱出来的是哪种蛋白质？为什么？
(2)d是什么？有什么特点？
(3)层析柱装填时不能有气泡的原因是什么？
[提示](1)a蛋白质先洗脱出来，因为a的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。
(2)d是多孔板，蛋白质可以通过，凝胶颗粒不能通过。
(3)气泡会扰乱蛋白质的洗脱次序，干扰实验结果。
重 难 精 讲
1．常用的蛋白质分离方法
(1)凝胶色谱法
蛋白质 项目 相对分子质量大 相对分子质量小
凝胶内部 不能进入 能进入
运动方式 垂直向下 垂直向下和无 规则扩散运动
经过路程 较短 较长
洗脱次序 先流出 后流出
(2)电泳法原理
a．在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
b．由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
2．比较琼脂糖凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
精 准 命 题
例1　(2017·重庆八中考试) 随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。如图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”，请回答下列有关问题：
―→
―→―→
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用生理盐水反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是渗透作用(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去小分子杂质，若要尽快达到理想的透析效果，可以增加缓冲液的量或及时更换缓冲液(写出一种方法)。
(3)血红蛋白的纯化是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。
(4)电泳利用了待分离样品中各种分子的带电性质以及分子大小、形状等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
〔对应训练〕
1．仔细观察下图，所带负电荷最少的球蛋白是(　D　)
A．α1—球蛋白　　　　　　 B．α2—球蛋白
C．β—球蛋白 D．γ—球蛋白
[解析]　对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极。且γ—球蛋白距点样处最近，所以γ—球蛋白所带负电荷最少。
考点二　植物有效成分的提取
,　)
1．提取玫瑰精油实验
(1)方法：水蒸气蒸馏法。
(2)实验流程：
2．提取橘皮精油的实验
(1)方法：一般采用压榨法。
(2)实验流程
3．胡萝卜素的提取
(1)胡萝卜素性质：不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。
(2)提取方法及流程
①方法：萃取法，石油醚最适宜作萃取剂。
②实验流程
胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。
(3)鉴定方法：纸层析法。
,　　)
易错整合，判断正误。
(1)油水混合物中加入无水硫酸钠，有利于分离油层(　×　)
(2)蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解出来，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油(　×　)
(3)原料易焦糊和有效成分易水解的植物芳香油的提取，不宜采用水蒸气蒸馏法，宜采用压榨法(　√　)
(4)萃取是利用了芳香油易溶于有机溶剂的特性进行提取的一种方法(　√　)
(5)由于胡萝卜素易溶于石油醚等有机溶剂中，所以可以采用萃取的方法进行提取(　√　)
(6)影响萃取效率的因素除了萃取剂的性质和使用量之外，还有原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等(　√　)
,　　)
　下图是提取植物有效成分的两种方法，据图分析：
(1)图甲、图乙分别为何种装置？
(2)图中a、b哪一个是进水口，哪一个为出水口？加热时为何常向液体中加入几片碎石或瓷片？
(3)提取玫瑰精油时，能否用干燥的玫瑰花？
(4)在提取橘皮精油的实验中，使用石灰水充分浸泡原料的目的是什么？
[提示](1)图甲为水蒸气蒸馏装置，图乙为萃取装置。
(2)图中a为出水口，b为进水口，这与蒸气流方向相反；加热时向液体中加入几片碎石或瓷片的目的是“防暴沸”。
(3)由于玫瑰精油易挥发，干燥后玫瑰精油已挥发。因此用水蒸气蒸馏法提取玫瑰精油时应选择新鲜的玫瑰花。
(4)目的是破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。
重 难 精 讲
1．三种提取方法的比较
提取方法 水蒸气蒸馏法 压榨法 有机溶剂萃取法
实验原理 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香油
方法步骤 ①水蒸气蒸馏 ②分离油层 ③除水过滤 ①石灰水浸泡、漂洗 ②压榨、过滤、静置 ③再次过滤 ①粉碎、干燥 ②萃取、过滤 ③浓缩
适用范围 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中
优点 简单易行，便于分离 生产成本低，易保持原料原有的结构和功能 出油率高，易分离
局限性 水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题 分离较为困难，出油率相对较低 使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量
2.植物有效成分提取过程的注意事项
(1)在玫瑰精油的提取过程中，加入NaCl的目的是增加水层的密度，有利于玫瑰油与水分层，加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。
(2)在提取橘皮精油时，为了提高出油率，需要将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，浸泡时间为10 h以上。橘皮要浸透，这样压榨时不会滑脱，且出油率高，过滤时不会堵塞筛眼。
(3)在胡萝卜素的提取中，原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件也能影响萃取。因此在萃取的过程中，要先将胡萝卜进行粉碎和干燥，使之与萃取剂充分接触，提高溶解度。
[易错警示]
(1)植物芳香油提取成功的关键点
①水蒸气蒸馏要适当延长蒸馏时间，温度不能太高。
②用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质。
③压榨时原料必须要浸透，这样压榨时不会滑脱，出油率高，不堵塞筛眼；使用石灰水充分浸泡原料的目的是破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。
(2)影响萃取的因素
①主要因素：萃取剂的性质和使用量
②次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度、萃取的时间等。总之，溶解越充分，效果就越好。
(3)水蒸气蒸馏法特点
①水中蒸馏设备简单、成本低、易操作，而水上蒸馏和水气蒸馏时间短，出油率高。
②水中蒸馏对于柑橘和柠檬等原料不适用。因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解。
③水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。
精 准 命 题
例2　(2015·全国卷Ⅱ)回答与胡萝卜素有关的问题：
(1)胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是β－胡萝卜素(填“α－胡萝卜素”“β－胡萝卜素”或“γ－胡萝卜素”)，该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子维生素A，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为夜盲症。胡萝卜素是非挥发性(填“挥发性”或“非挥发性”)物质。
(2)工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时，需要(填“需要”或“不需要”)将新鲜的岩藻干燥。
(3)现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的乙酸乙酯作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇为水溶性有机溶剂。
[解析]　(1)胡萝卜含有的胡萝卜素有三类，其中最主要的是β－胡萝卜素，β－胡萝卜素在人体内可以转变成维生素A，维生素A缺乏会导致夜盲症。胡萝卜素是非挥发性物质。(2)胡萝卜素的提取一般采用萃取法，萃取前需要对材料进行干燥处理，以提高萃取的效率。(3)萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有很高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶，如乙酸乙酯。乙醇是水溶性有机溶剂，因萃取过程中能与水混溶而影响萃取效果，所以不选用它作萃取剂。
〔对应训练〕
2．(2017·广东广州毕业班一测)工业生产中，提取天然β－胡萝卜素的方法之一是利用红酵母等微生物进行发酵，经过菌体裂解、离心后进行萃取。回答以下有关问题：
(1)若要初步确定某一菌株是否为红酵母菌株，相对简便的操作是通过平板划线法将菌种接种于固体培养基上，并在适宜的条件下培养一段时间，观察其形成的菌落的颜色、大小、形状、隆起程度(填两个)等特征。
(2)碳源的种类对β－胡萝卜素的产量有着一定的影响，有关研究结果如下：
碳源 麦芽糖 蔗糖 淀粉
β－胡萝卜素 含量(mg/L) 3.52 4.81 1.68
据表分析，最佳碳源是蔗糖。若要进一步探究最佳氮源，请简要写出实验设计思路：以蔗糖为碳源，分别用不同氮源进行实验，检测并比较β－胡萝卜素含量。
(3)有科研人员尝试利用紫外线处理红酵母，以获得高产菌株。对处理所得菌株分别进行培养并经裂解、离心后，根据β－胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点，可以采用有机溶剂萃取法萃取产物，并对萃取产物通过纸层析法进行鉴定，鉴定过程需要用标准样品进行对比。经定量分析后，若得到高产菌株，要对其进行长期保存，可采用甘油管藏法在－20℃的冷冻箱中保存。
[解析]　(1)鉴别红酵母菌株相对简便的接种方法是平板划线法。通过观察菌落的颜色、形态、大小、隆起程度等特征来鉴别菌种。(2)由表中数据可知，以蔗糖为碳源的培养基中β－胡萝卜素的含量最高。若要进一步探究最佳氮源，应以蔗糖为碳源，设置不同的氮源为自变量进行实验，检测并比较β－胡萝卜素含量。(3)根据β－胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点，用有机溶剂进行萃取，利用不同色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸条上扩散的速度不同，从而对不同色素进行分离，故萃取产物可用纸层析法进行鉴定。鉴定过程需要与标准样品进行对比确定β－胡萝卜素在滤纸条上的位置。对菌株进行长期保存，可采用甘油管藏法，在－20℃的冷冻箱里保存。
3．(2018·四川绵阳二诊)提取植物有效成分时，不同的有机物具有不同的理化特性，所采用的提取方法也不同。分析下列关于提取植物有效成分的实验，回答相关问题：
(1)薰衣草精油是从薰衣草中提炼的，可以清热解毒，清洁皮肤。下面是某同学设计的提取薰衣草精油的实验流程：
薰衣草＋水→A→油水混合物分离油层除水→B→薰衣草精油
图中的A表示水蒸气蒸馏过程，在此过程中，影响薰衣草精油提取量的主要因素有蒸馏的温度和时间，B过程的目的是除去无水硫酸钠(或“除去乙”)。
(2)提取柠檬精油时，常采用压榨法而不用上述提取薰衣草精油的方法，原因是水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题。
(3)胡萝卜素化学性质比较稳定，易溶于有机溶剂，可采用萃取法提取。萃取时选择的有机溶剂应具有的特点是具有较高的沸点、能够充分溶解胡萝卜素、不与水混溶(答出三点即可)，萃取装置要在加热瓶口安装回流冷凝装置，其目的是防止加热时有机溶剂挥发。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．辨析胡萝卜素粗品鉴定过程中的四个易错点
(1)层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显。
(2)点样时点样圆点太大(直径大于2 mm)导致最终无法辨认被提取的色素。
(3)将点好样的滤纸卷成圆筒时，滤纸两边不能相互接触。
(4)层析液不可没及样品原点。
2．增加植物有效成分提取量的关键措施
(1)用水蒸气蒸馏法提取植物芳香油时应选择新鲜的植物材料(干燥后植物芳香油挥发)。
(2)植物材料中的果胶、果蜡会影响压榨和出油率，压榨前通常采用石灰水浸泡的方法除去果胶、果蜡，以提高出油率。
3．〔探究高考·明确考向〕
　(2017·全国卷Ⅲ，37)绿色植物甲含有物质W，该物质为无色针状晶体，易溶于极性有机溶剂，难溶于水，且受热、受潮易分解。其提取流程为：植物甲→粉碎→加溶剂→振荡→收集提取液→活性炭处理→过滤去除活性炭→蒸馏(含回收溶剂)→重结晶→成品。回答下列问题：
(1)在提取物质W时，最好应选用的一种原料是晾干(填“高温烘干”“晾干”或“新鲜”)的植物甲，不宜选用其他两种的原因是高温烘干过程中，植物甲中的物质W易被破坏；新鲜的植物甲含水量高，用于提取的极性有机溶剂会被水稀释，进而降低对物质W的提取效果。
(2)提取物质W时，振荡的作用是使原料和溶剂充分混匀。
(3)活性炭具有很强的吸附能力，在提取过程中，用活性炭处理提取液的目的是去除提取液中的色素。
(4)现有丙酮(沸点56 ℃)、乙醇(沸点约78 ℃)两种溶剂，在提取物质W时，应选用丙酮作为提取剂，理由是丙酮沸点低于乙醇，蒸馏时物质W分解较少。
(5)该实验操作过程中应注意的事项是在温度较低的情况下操作，防火(答出两点即可)。
[解析]　(1)依据题干信息，物质W受热、受潮易分解，因此不宜选择高温烘干的原料，而新鲜的植物甲含水量高，用于提取的极性有机溶剂会被水稀释，进而降低对物质W的提取效果，故不应选用新鲜的植物甲。(2)提取物质W时，振荡可以使原料和所加有机溶剂充分混匀。(3)利用活性炭的吸附能力，可以去除提取液中植物甲所含的色素，从而得到较为纯净的物质W与有机溶剂的混合物。(4)丙酮沸点低于乙醇，蒸馏时物质W分解较少。(5)物质W容易受热分解，因此蒸馏操作适宜在较低的温度下进行，同时因实验中使用了有机溶剂，要注意防火。
考能提升(八)　生物技术实践
〔易 错 清 零〕
易错点1　不明确发酵后酒精的检测与对照组的设置
点拨：发酵后酒精的检验及对照原则
①检验
→3 mol/L的H2SO43滴→振荡混匀→重铬酸钾溶液3滴→振荡试管→观察
→3 mol/L的H2SO43滴→振荡混匀→重铬酸钾溶液3滴→振荡试管→观察
②对照
两种对照方式都必须遵循单一变量原则：前者是标准对照，后者是自身对照。
易错点2　不明确泡菜制作中盐水(清水：盐＝4：1)煮沸的两层面意义
点拨：清水和盐的质量比为4：1，盐水要煮沸后冷却再使用。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
易错点3　误认为所有微生物培养基中均需加入“生长因子”
点拨：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子是微生物生长必需的五大营养成分，但大多数培养基中都含碳源、氮源、水、无机盐四类物质，可能不需额外添加“生长因子(如维生素)”，这是因为许多微生物可自行合成这些生长因子，而对那些合成能力有限或不能合成生长因子的微生物(如乳酸菌)，则需在培养基中添加诸如维生素等生长因子。
易错点4　不明确每次划线操作中“灼烧接种环”的目的或误认为划线结束后“不必灼烧接种环”
点拨：平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同
①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。
②每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。
③划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
易错点5　不知道菌落计数比实际值“偏高”还是“偏低”
点拨：稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法中由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能“偏高”。
〔核 心 强 化〕
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质 依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计 鉴别不同种类的微生物 伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
2.选择培养基四种常见制备方法或实例
〔状 元 笔 记〕
规 范 养 成
案例　生物技术实践规范审答案例
批阅答卷——判断对错，查找误区
有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以原油①为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于鉴别②培养基。
(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即平板划线法③和稀释涂布平板法④。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力强⑤。
(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、加热灭菌⑥和高压灭菌⑦。无菌技术要求实验操作应在酒精灯火焰⑧附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
评析矫正——辨析误区，规范审答
错因分析 正确答案
② 理解不到位 选择
⑥ 生物学专用术语运用不规范 干热灭菌
⑦ 高压蒸气灭菌
状 元 解 题
案 例 　工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高水果的出汁率，为研究温度对果胶酶活性的影响，某同学设计了如下实验：
①将果胶酶与苹果泥分装于不同试管 ，在10 ℃水浴中恒温处理10 min(如图甲)。
②将步骤①处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10 ℃水浴中恒温处理10 min(如图乙)。
③将步骤②处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量(如图丙)。
④在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：
温度/℃ 10 20 30 40 50 60 70 80
果汁量/mL 8 13 15 25 15 12 11 10
根据上述实验，请分析回答下列问题。
(1)果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以促进细胞壁中果胶的水解。
(2)实验结果证明，当温度为40_℃左右时，果汁量最多，此时果胶酶的活性最高。当温度再升高时，果汁量降低，说明酶的活性降低。
(3)实验步骤①的目的避免果汁和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶的活性。
[思路分析]　(1)植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一是果胶，而果胶酶则是水解果胶的一类酶的总称。(2)通过表中数据可知：在40 ℃时，产生的果汁量最多，在题中所给的温度范围内，40 ℃时酶活性最高。当温度再升高时，出汁量降低，酶的催化活性降低。(3)酶具有高效性，需保证混合物的温度维持在10 ℃。
使果胶酶和苹果泥达到相同的温度再混合。
易错点：对果胶酶在果汁生产中的应用理解不清。
错因分析：对细胞壁的成分记忆不清及对酶的高效性理解不到位。
长句应答突破简答题
1．下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
(1)图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用稀释涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。
(2)接种操作要在火焰附近进行的原因是火焰附近存在着无菌区域。
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
2．下表为传统发酵食品的制作装置图，请据图分析：
食品 果酒 果醋 腐乳 泡菜
制作 装置 或操 作步 骤
(1)图中利用的主要菌种依次为酵母菌、醋酸菌、毛霉、乳酸菌；其中属于真核生物的是酵母菌、毛霉，因为它们具有以核膜为界限的细胞核。
(2)甲～丁装置或者步骤是否存在缺陷？试具体分析：甲装置中排气管不应插入到发酵液内，丙装置接种应在“加盐”之前，不应在“加盐”后接种。
(3)甲装置留有1/3空间的目的是：①先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；②防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。
(4)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是防止杂菌污染；为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作用是增加乳酸菌数量，加速乳酸产生。
针 对 训 练
〔训练1〕　β－胡萝卜素是一种色泽鲜艳、对人体有益的天然色素类食品添加剂，可从胡萝卜或产胡萝卜素的酵母菌菌体中提取获得，操作流程如图l所示。图2是样品层析结果与β－胡萝卜素标准样品的比对。请分析并回答下列问题：
(1)发酵罐内培养酵母菌R时，培养基中添加玉米粉和豆饼的目的主要是为微生物的生长提供碳源和氮源。如果要测定发酵罐中酵母菌的种群数量，抽样后可借助血细胞计数板，利用显微镜直接计数测定酵母菌的数量。
(2)图1中，干燥过程应控制好温度和干燥时间，以防止胡萝卜素的分解；萃取过程中宜采用水浴加热，原因是有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、爆炸。
(3)图中A过程表示过滤，其目的是除去萃取液中的不溶物。
(4)纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。从图2分析可知，层析后在滤纸上出现高度不同的色素带，说明提取到的胡萝卜素含杂质，色带I为β－胡萝卜素。
〔训练2〕　牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：
(1)巴氏消毒的方法是70～75_℃煮30分钟(80_℃煮15分钟)，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是牛奶的营养成分不被破坏。
(2)取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图中的B。
(3)图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为3.4×106个，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小(填“偏大”或“偏小”)，原因是个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的。
(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？稀释次数减少。
(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入伊红美蓝(金属光泽的紫)，菌落具有黑色特征的可以认定为大肠杆菌。

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