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基因工程：
第1节　重组DNA技术的基本工具
学有目标——新课程标准必明 记在平时——核心语句必背
1.概述DNA重组技术所需的三种基本工具及其作用。 2．阐明基因工程载体需要具备的条件。 3．理解DNA粗提取和鉴定的原理，学会DNA的粗提取和鉴定方法。 1.限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 2．E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。 3．质粒作为基因工程的载体需具备的条件：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因。 4．DNA粗提取与鉴定的原理：DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，不溶于酒精，在沸水浴条件下遇二苯胺会呈现蓝色。
一、理清主干知识
一、基因工程(重组DNA技术)的概念
手段 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性
目的 按照人们的愿望，进行严格的设计，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
操作水平 DNA分子水平
二、基因工程的诞生和发展
1．基础理论
(1)DNA是遗传物质的证明。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
2．技术支持
(1)基因转移载体和工具酶的发现。
(2)DNA体外重组的实现。
(3)重组DNA表达实验的成功。
(4)DNA测序和合成技术的发明。
(5)PCR技术的发明。
三、重组DNA技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
(2)作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)作用结果：产生黏性末端或平末端。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)种类
项目 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端 既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端
(2)作用
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
(2)种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
(3)条件
四、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
(1)DNA不溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2．实验流程
―→―→―→
二、诊断自学效果
1．判断下列叙述的正误
(1)限制酶只能用于切割目的基因(×)
(2)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(3)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(4)用作载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(√)
(5)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)
(6)在溶有DNA的 NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(×)
2．(2020·日照期末)下列关于基因工程的叙述，错误的是(　　)
A．基因工程的原理是染色体变异
B．基因工程可定向改变生物的性状
C．基因工程是在分子水平上进行的设计和施工
D．基因工程可以将外源基因导入不同种的生物体内
解析：选A　基因工程的原理是基因重组，A错误；基因工程可按照人们的意愿定向改变生物的性状，B正确；基因工程是在分子水平上进行的设计和施工，C正确；基因工程可以将外源基因导入不同种的生物体内，D正确。
3．在如图过程中发挥作用的酶是(　　)
A．RNA聚合酶　　　　　 B．DNA连接酶
C．DNA聚合酶 D．限制性内切核酸酶
解析：选D　限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，形成黏性末端。
4．质粒是某些生物细胞中的有机分子，下列相关叙述错误的是(　　)
A．质粒只存在于原核生物中
B．质粒能够自主复制
C．质粒中不含游离的磷酸基团
D．质粒常作为基因工程的运载工具
解析：选A　质粒是广泛存在于细菌、酵母菌等微生物体内的一种小型的环状DNA分子，A错误；质粒是一种具有自主复制能力的很小的双链环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，B、C正确；质粒常作为基因工程的载体，D正确。
[在探究中学明]
“工欲善其事，必先利其器”。我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行切割、改造、修饰和拼接，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。
1．已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为
，分析回答：
(1)在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
(2)写出产生的末端种类：①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。
(3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
(4)要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要T4_DNA连接酶。
2．限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。在质粒上有限制酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个限制酶Ⅱ的切点。
(1)请写出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。
提示：　
(2)请写出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的黏性末端。
提示：GATC
　　 　 　　—……—CTAG
(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？
提示：能。因为上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的。
[在深化中提能]
1．对基因工程概念的理解
基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
原理 基因重组
结果 获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点 克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状
2．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
耐高温的 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
　(2020·潍坊期末)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　)
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
[解析]　由图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
[答案]　C
判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。
　　　
[在应用中落实]
1．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，错误的是(　　)
A．一种限制酶只能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
B．DNA连接酶可催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
C．E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离出来的，它只能连接黏性末端
D．T4 DNA连接酶既可连接黏性末端，也可连接平末端，但连接黏性末端的效率较低
解析：选D　限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，A正确；DNA连接酶可催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确；E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离出来的，它只能连接黏性末端，C正确；T4 DNA连接酶既可连接黏性末端，也可连接平末端，但连接平末端的效率较低，D错误。
2．下列黏性末端是由同一种限制酶切割而成的是(　　)
A．①③　　　　　　　　 B．③④
C．②④ D．②③
解析：选A　限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。限制酶识别的核苷酸序列是具有特定结构的DNA片段，切割后形成的黏性末端能够互补配对，题图中①与③能够互补，其他的不能互补，因此①与③是由同一种限制酶切割而成的。
[在探究中学明]
载体作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞中去，并在受体细胞内大量复制。常用的载体有质粒、病毒等。阅读教材，观察图示回答相关问题。
1．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
2．若质粒DNA分子的切割末端为 ，则与之连接的目的基因切割末端应为；可使用DNA连接酶把质粒和目的基因连接起来。
3．氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上，称为标记基因，其作用是供重组DNA分子的鉴定和选择。
[在深化中提能]
1．使用载体的目的
在基因工程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。
2．作为载体必需具备的条件
(1)有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。
(2)能够在受体细胞中保留下来，且载体DNA必须具备自我复制能力；或能够整合到受体DNA上，并随受体DNA同步复制。
(3)带有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
(4)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动。
3．常用载体的种类及用途
种类 用途
质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
噬菌体
植物病毒 将外源基因导入植物细胞
动物病毒 将外源基因导入动物细胞
4．载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因，目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗生素抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
　下列有关基因工程中载体的叙述，错误的是(　　)
A．载体将目的基因带入受体细胞中，可自我复制或整合到受体DNA上
B．基因工程的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等
C．携带目的基因的载体不必有标记基因
D．能表达目的基因的载体必须有RNA聚合酶识别和结合的特定部位
[解析]　载体将目的基因导入受体细胞，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，A正确；基因工程的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等，B正确；携带目的基因的载体需要有标记基因，以便于筛选重组后含有目的基因的受体细胞，C错误；能表达目的基因的载体必须有RNA聚合酶识别位点和结合的特定部位，以便与RNA聚合酶结合发生转录，从而使目的基因得以表达，D正确。
[答案]　C
细胞膜上的“载体”与基因工程中“载体”的区别
(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、噬菌体；也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
　　　
[在应用中落实]
1．下列关于质粒的叙述，错误的是(　　)
A．质粒是一种小型环状双链DNA分子
B．质粒的基本组成单位是脱氧核苷酸
C．质粒只有进入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制
D．基因工程中常用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
解析：选C　质粒是一种具有自我复制能力的小型环状双链DNA分子，A正确；质粒是DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸，B正确；质粒不一定要在宿主细胞内复制，在原生物体内也会复制，C错误；基因工程中常用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，D正确。
2．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制原点，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TctR为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　)
解析：选C　A图中酶切位点在ori序列上，该序列被破坏，重组质粒将无法进行复制，因此受体细胞既不能在四环素培养基上生长，也不能在氨苄青霉素培养基上生长。B图中限制性内切核酸酶没有破坏三个基因，因此含重组DNA的细胞既能在四环素培养基上生长，也能在氨苄青霉素培养基上生长。C图中酶切位点在氨苄青霉素抗性基因上，氨苄青霉素抗性基因被破坏，则含重组DNA的细胞能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D图中酶切位点在四环素抗性基因上，由于仅四环素抗性基因被破坏，则含重组DNA的细胞能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长。
[在探究中学明]
1．可否选用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，为什么？
提示：不可以，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
2．DNA和蛋白质在酒精中的溶解性有何特点？根据该特点如何将DNA与蛋白质初步分离？
提示：DNA不溶于酒精，某些蛋白质能溶于酒精。向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入冷却的酒精，溶液中会出现白色丝状物，即粗提取的DNA。
3．完善DNA粗提取与鉴定的实验流程图：
[在深化中提能]
1．DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作材料。
(2)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(3)提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。
(4)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
2．DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同
项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解
总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。当NaCl溶液的物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度的增加而逐渐降低；NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液的物质的量浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。②选择适当的盐溶液能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的
　　(2020·沈阳期末)下列与DNA粗提取和鉴定过程有关的叙述，正确的是(　　)
A．将猪的成熟红细胞置于清水中，红细胞涨破后将DNA释放出来
B．用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液
C．在提取液中加入体积分数为75%的冰酒精后DNA会与蛋白质分离并析出
D．将提取到的丝状物与二苯胺试剂充分混匀后溶液迅速变为蓝色
[解析]　猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，故用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液，B正确；在提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后DNA会与蛋白质分离并析出，C错误；将提取到的丝状物先溶解到2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热后溶液变为蓝色，D错误。
[答案]　B
根据DNA的溶解性判断DNA的去向
(1)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解，过滤后要保留滤液。
(2)DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中析出，过滤后要保留黏稠物，舍弃滤液。
(3)DNA在加入体积分数为95%的预冷的酒精溶液中析出，用玻璃棒卷起丝状物即可，不用过滤。
　　　
[在应用中落实]
1．(2020·苏州期中)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物
D．实验结束后应保存好剩余的二苯胺试剂，以备下次实验时使用
解析：选C　植物细胞有细胞壁，不能吸水涨破释放核DNA，A错误；鉴定DNA时，应将丝状物先溶于2 mol/L的NaCl溶液，然后再加入二苯胺试剂进行沸水浴加热，B错误；DNA不溶于酒精，因此向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物，C正确；二苯胺试剂应该现配现用，否则会影响实验结果，D错误。
2．如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列有关叙述错误的是(　　)
A．图1中的丝状物含有DNA
B．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C．图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化
D．图2中的溶液b能够溶解DNA
解析：选B　图1中的丝状物含有DNA，A正确；图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，B错误；图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化，C正确；图2中的溶液b是NaCl溶液，能够溶解DNA，D正确。
　　　　[课堂巩固落实]
1．有关基因工程操作工具的叙述正确的是(　　)
A．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B．质粒是基因工程中唯一的载体
C．载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D．DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键
解析：选A　限制酶具有专一性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，A正确；质粒是基因工程中最常用的载体，此外还可以用动植物病毒或噬菌体等，B错误；载体必须具备的条件之一是具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接，C错误；DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键，D错误。
2．如图为DNA分子的某一片段，①②③表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是(　　)
A．限制酶、解旋酶、DNA连接酶
B．解旋酶、限制酶、DNA连接酶
C．解旋酶、DNA连接酶、限制酶
D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶
解析：选B　①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。
3．(2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析：选A　哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多的细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。
4．为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶BglⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题：
(1)根据图3分别写出BglⅡ与BamHⅠ酶切后形成的末端序列：__________________、__________________。
(2)使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到______________________________________
________________________。
(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是________________________________________________________________________
______________________________。
(4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择____________________________________的培养基。
解析：(1)限制酶Bgl Ⅱ与BamHⅠ切割形成的序列依次为：
或、或。(2)BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后的目的基因形成的重组DNA分子上没有BglⅡ酶的识别序列，因此使用BglⅡ处理重组质粒，得到是长度为3 300 bp的环状双链DNA。(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y具有相同的黏性末端，根据碱基互补配对原则，它们能够连接形成重组DNA。(4)由于质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR，因此要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基。
答案：(1) 或　或
(2)长度为3 300 bp的环状双链DNA　(3)酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则　(4)含卡那霉素但不含亮氨酸

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