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　基因工程与必修课程相关知识的综合
[素能建构]
交汇点1　高中生物学中所学习的载体
(1)物质跨膜运输的载体：细胞膜上的一种蛋白质。
(2)血液中O2运输的载体：红细胞中的血红蛋白。
(3)基因工程中目的基因的载体：种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
(4)细胞中遗传信息的载体：细胞生物遗传信息的载体是DNA。
(5)细胞核向细胞质传递信息的载体是mRNA。
(6)细胞间信息传递的载体：细胞释放的信号分子，如激素、神经递质等。
交汇点2　基因表达载体中的启动子、终止子，联系必修课程模块2中“基因的表达”和“mRNA中的起始密码子、终止密码子”交汇考查
(1)基因表达的过程包括转录和翻译。
(2)启动子、终止子是基因上的具有特殊结构的DNA片段。
(3)起始密码子、终止密码子是mRNA上的三个相邻碱基。
交汇点3　基因工程工具酶——限制性内切核酸酶，联系必修课程模块1中“有关酶的本质和特性”交汇考查
限制性内切核酸酶相关知识：
(1)本质：蛋白质。
(2)特性：具有特异性。
①一种限制酶只能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②切割双链DNA分子每条链中特定序列中的特定位点，使该位点的磷酸二酯键断开。
(3)作用：断开连接两个核苷酸的磷酸二酯键。
交汇点4　基因工程中目的基因、基因表达载体的化学组成及结构，联系必修课程模块2中“DNA分子的组成、结构”交汇考查
(1)DNA分子的基本组成单位：脱氧核糖核苷酸。
(2)DNA分子结构：DNA是由脱氧核苷酸连接而成的长链，相邻脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接；在绝大多数生物的细胞中，DNA由两条脱氧核苷酸链构成，两条链通过碱基对之间的氢键相连；少数生物细胞中存在环状双链DNA分子。
[对点训练]
1．在一个典型的基因内部，启动子(TSS)、终止子(TTS)、起始密码子编码序列(ATG)、终止密码子编码序列(TGA)的排列顺序是(　　)
A．ATG—TGA—TSS—TTS
B．TSS—ATG—TGA一TTS
C．ATG—TSS—TTS—TGA
D．TSS—TTS—ATG—TGA
B　[在基因内部，不同位点的排列顺序为：转录起始位点—起始密码子编码序列—终止密码子编码序列—转录终止位点。]
2．纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精，构建了含3种不同基因片段的重组质粒。下图是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。
据图回答：
(1)纤维素酶基因的表达包括________和________过程。与菌株Ⅱ相比，在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有________。
(2)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，菌株________不能存活，原因是_____________________________________________
_______________________________________________________________。
(3)酵母菌生成酒精的细胞部位是________，产生酒精时细胞的呼吸方式是________。在利用纤维素生产酒精时，菌株Ⅳ更具优势，因为导入的重组质粒含有____________，使分泌的纤维素酶固定于细胞壁，减少因培养液更新而造成的酶的流失，提高酶的利用率。
[解析]　(1)基因表达的过程包括转录和翻译。菌株Ⅱ能合成纤维素酶，但不能分泌到细胞外，菌株Ⅲ、Ⅳ能够合成和分泌纤维素酶。与菌株Ⅱ相比，在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网和高尔基体。
(2)菌株Ⅱ导入的表达载体中不含信号肽编码序列，因此合成的纤维素酶不能分泌到细胞外，不能利用纤维素，又无其他碳源，因此不能存活。
(3)菌株Ⅳ因导入的载体中有A基因片段，使其分泌的纤维素酶吸附在细胞壁上，减少了因培养液更新而造成的酶的流失，酶的利用率提高。
[答案]　(1)转录　翻译　内质网、高尔基体
(2)Ⅱ　缺少信号肽编码序列，合成的纤维素酶不能分泌到细胞外，细胞无可利用的碳源
(3)细胞质基质　无氧呼吸　A基因片段
3．为提高水稻的抗旱能力，科研人员将拟南芥GolS2基因导入水稻体内后，设法使该基因过量表达，产生较多的糖类化合物，从而达到预期目的。回答下列问题：
(1)从分子水平上看，基因工程得以实现的遗传学物质基础是____________
________、________________________。
(2)GolS2基因在水稻体内过量表达即可提高抗旱能力，说明基因通过________________________，进而控制生物性状，细胞内糖类化合物含量增多可以提高抗旱能力的原因是___________________________________________
_____________________________________________________________。
(3)需将GolS2基因拼接在运载体上才能成功转化，转化指的是_________
_____________________________________________________________。
GolS2基因在水稻体内能过量表达，是科学家对基因表达载体上的________进行修饰的结果。
(4)对导入了基因表达载体的细胞进行组织培养，需为其提供适宜的温度和pH外，还需满足的条件有_____________________________________________
_______(至少答出三点)。
[解析]　(1)基因工程得以实现的遗传学物质基础体现在两方面：一是DNA的基本结构相同，可以使不同生物的DNA分子拼接在一起，构建基因表达载体；另一方面是基因表达的机制相同，所有生物共用一套密码子。
(2)GolS2基因与糖类合成有关，而糖的合成需要酶的催化，因此GolS2基因通过控制酶的合成来控制糖代谢过程，进而控制生物性状。从题意来看，细胞内GolS2基因的过量表达，使得细胞内糖类增多，增加了细胞液的浓度，进而使细胞吸水或保水能力增加。
(3)转化是指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。表达的第一个环节是转录，因此，修饰的应该是启动子(调控基因转录的核苷酸序列)。
(4)植物组织培养过程除需要适宜的温度和pH，还需植物激素的调控、适宜的营养以及无菌条件等。
[答案]　(1)不同生物DNA分子的基本结构相同(或“不同生物DNA分子都是双螺旋结构”)　所有生物共用一套密码子(需从核酸的角度回答，可以说转录和翻译的机制相同，合理即可)
(2)控制酶的合成来控制代谢过程　细胞内糖类增多，增加了细胞液的浓度，进而使细胞吸水或保水能力增加
(3)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程　启动子
(4)一定的激素条件、适宜的营养、无菌环境
　基因工程与选择性必修课程相关知识的综合
[素能建构]
交汇点1　基因工程的应用广泛，特别是在医药卫生领域的应用，很多抗体、疫苗、激素等都可通过基因工程生产，因此基因工程与选择性必修模块1中的激素调节、免疫调节可进行交汇考查
交汇点2　基因工程的应用还可能与本模块中“体细胞核移植”“单克隆抗体”等知识交汇考查
[对点训练]
1．在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是________，合成胰高血糖素的细胞是________。
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的________序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体。再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成________的基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原—抗体反应，菌体有抗原—抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从________中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
[解析]　(1)由题意可知，前胰岛素原在细胞内经加工后成为胰岛素，人体合成胰岛素的细胞是胰岛B细胞，所以合成前胰岛素原的细胞也是胰岛B细胞；合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。
(2)根据胰岛素原的氨基酸序列，可设计并合成编码胰岛素原的DNA序列(即目的基因)；用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成人胰岛素原的基因工程菌。
(3)根据题意，培养液无抗原—抗体反应，菌体有抗原—抗体反应，所以用该工程菌进行工业发酵时，应从菌体中分离、纯化胰岛素原，经酶处理便可转变为胰岛素。
[答案]　(1)胰岛B细胞　胰岛A细胞　(2)DNA　胰岛素原　(3)菌体
2．人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：
请回答：
(1)过程①代表的是________。
(2)过程②构建A基因表达载体时，必须使用________和________两种工具酶。
(3)过程③采用的实验技术是________，获得的X是________。
(4)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的________所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行________比较；或用图中的________进行特异性结合检测。
[解析]　(1)中心法则中，对于少数的以RNA为遗传物质的病毒，其遗传信息的传递过程需要补充的过程有RNA的逆转录和RNA的复制的过程，图中过程①代表的是逆转录过程。
(2)基因工程的步骤是：目的基因的提取——构建基因表达载体——导入受体细胞——目的基因的检测和表达，其中构建基因表达载体中需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和载体。
(3)过程③是将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的过程，获得杂交瘤细胞，其具备了骨髓瘤细胞无限增殖的特性和B淋巴细胞产生抗体的特性，从而制备单克隆抗体。
(4)本题考察了免疫预防的操作过程，以及欲确诊疑似患者而采取的方法。本题中提示该RNA病毒表面的A蛋白为主要的抗原，故而可选用通过基因工程生产的A蛋白制备疫苗；确诊时为判断该病毒是否为题目中的RNA病毒，可以进行核酸序列的比对，也可以利用抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测。
[答案]　(1)逆转录
(2)限制性内切核酸酶(限制酶、限制性内切酶)　DNA连接酶(两空可以互换)
(3)细胞融合　杂交瘤细胞
(4)A蛋白　核酸(基因)序列　抗A蛋白的单克隆抗体
3．乳腺炎和口蹄疫分别是由细菌和病毒引起的危害奶牛养殖业的两种严重疾病。研究者利用生物技术培育出转牛乳铁蛋白肽(抗细菌)和人干扰素(抗病毒)的双转基因奶牛新品种。图1为基因表达载体，图2为培育流程。
(1)培育双转基因奶牛涉及的生物技术有____________________(至少2项)。
(2)牛乳铁蛋白肽基因能在转基因奶牛的乳腺细胞表达，人干扰素基因则可在全身细胞表达，这与构建表达载体时的________选择有关。据图可知，干扰素基因与________基因可同时转录，但在翻译时，核糖体可识别mRNA上IRES序列，启动另一条肽链的合成，因此用含有新霉素的培养基可筛选出____________________。
(3)将基因导入牛胎儿成纤维细胞前，需用________将其处理成单个细胞。成纤维细胞无法直接发育成个体，需要去核卵母细胞的细胞质诱导，以实现细胞核的________。
(4)研究者利用________技术筛选出________(填“牛乳铁蛋白”或“干扰素”)成功表达的胚胎进行移植。
[解析]　(1)据图分析，培育双转基因奶牛涉及的生物技术有基因工程、动物细胞培养、核移植、胚胎移植等。
(2)牛乳铁蛋白肽基因能在转基因奶牛的乳腺细胞表达，人干扰素基因则可在全身细胞表达，这与基因表达载体中的启动子有关。据图可知，干扰素基因与新霉素抗性基因同时介于启动子和终止子之间，所以这两个基因可同时转录，但翻译时，核糖体可识别mRNA上IRES序列，启动另一条肽链的合成，因此用含有新霉素的培养基可筛选出干扰素基因成功表达的细胞。
(3)胰蛋白酶可将组织块处理成为单个细胞，成纤维细胞需要去核卵母细胞的细胞质诱导，以实现细胞核的全能性。
(4)要对蛋白质进行筛选鉴定，应采用抗原—抗体杂交技术，又因为人干扰素基因可在全身细胞表达，牛乳铁蛋白肽基因只能在转基因奶牛的乳腺细胞表达，因此在对胚胎进行筛选时，应选择干扰素成功表达的胚胎。
[答案]　(1)基因工程、动物细胞培养、核移植、胚胎移植(至少答出2项)
(2)启动子　新霉素抗性　干扰素基因成功表达的细胞
(3)胰蛋白酶　全能性
(4)抗原—抗体杂交　干扰素
8/8阶段综合测评(三)　(第三章)
一、单项选择题：共15题，每题2分，共30分。每题只有一个选项最符合题意。
1．下列关于限制酶的说法，正确的是(　　)
A．限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质
B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D．限制酶均特异性地识别含6个核苷酸的序列
B　[限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，B正确；限制酶切割DNA后会形成黏性末端或平末端，C错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，D错误。]
2．右图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　)
A．目的基因插入位点
B．启动子
C．标记基因
D．DNA聚合酶识别位点
B　[基因表达载体由启动子、终止子、标记基因和目的基因组成。图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的首端，所以X最可能是启动子。B正确。]
3．下列关于基因表达载体及其构建的相关叙述，错误的是(　　)
A．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分
B．目的基因主要是指编码所需蛋白质的结构基因
C．构建基因表达载体需用限制酶和DNA连接酶
D．构建基因表达载体必须在细胞内进行
D　[一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；基因表达载体的构建是目的基因与载体结合，在此过程中需用同种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的。]
4．下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　)
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术的原理是DNA双链复制原理，需要模板、原料、能量、酶等条件
D　[PCR技术扩增的目的基因序列不一定是已知的，A项错误；PCR技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B项错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链的末端进行碱基配对，其序列不是互补的，C项错误；PCR技术的原理是DNA双链复制原理，需要模板、原料、酶、能量等条件，D项正确。]
5．下列有关基因工程的工具的叙述，正确的是(　　)
A．基因工程的载体都是质粒
B．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞
B　[基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等；λ噬菌体的衍生物不可作为动物基因工程的载体；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造。]
6．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，无需进行碱基互补配对的步骤是(　　)
A．PCR扩增目的基因 B．基因表达载体的构建
C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测与鉴定
C　[将目的基因导入受体细胞过程中没有进行碱基互补配对。]
7．某目的基因两侧的DNA序列所含限制酶的酶切位点如图所示，则在进行基因工程操作中最好应选用下列哪种质粒作为载体(　　)
D　[目的基因只有一侧含有限制酶Nhe Ⅰ的识别序列，因此不能用该酶获取目的基因，A错误；目的基因的两侧都含有限制酶Alu Ⅰ的识别序列，可以用该酶获取目的基因，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化，B错误；目的基因的一侧同时含有限制酶Nhe Ⅰ和Alu Ⅰ的识别序列，故用这两种酶切割可能会获得不含目的基因的片段，C错误；目的基因两侧分别含有限制酶Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ的识别序列，用这两种酶切割能获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D正确。]
8．运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用。据以上信息，下列叙述正确的是(　　)
A．Bt基因的化学成分是蛋白质
B．Bt基因中有菜青虫的遗传物质
C．转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因
D．转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物
C　[基因是有遗传效应的DNA片段，因此Bt基因的化学成分不是蛋白质，A错误；由题干信息“将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种”，可知Bt基因不是来源于菜青虫，不含有菜青虫的遗传物质，B错误；转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因，Bt基因能控制杀虫蛋白的合成，C正确；转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白属于有机物，D错误。]
9．下列有关动物基因工程的说法，错误的是(　　)
A．动物基因工程技术可以提高动物的生长速度
B．将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组中，获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低
C．用转基因动物作为器官移植的供体时，导入的是调节因子，不是目的基因，因此无法抑制抗原的合成
D．利用基因工程技术，得到的乳腺生物反应器可以解决很多重要药品的生产问题
C　[转基因动物作为器官移植的供体时，导入的调节因子也属于目的基因，可抑制抗原的合成。]
10．科学家运用转基因技术，将苏云金杆菌的抗虫基因DXT转移到大白菜细胞中，培育出抗虫效果很好的优质大白菜，减少了农药的使用量，减轻了农药对环境的污染。下列说法正确的是(　　)
A．用苏云金杆菌直接感染大白菜就可得到转基因大白菜
B．DXT基因能在大白菜细胞中正常表达
C．转基因大白菜培育的过程中，可以用灭活的病毒作为载体
D．转基因大白菜能抵抗各种病虫害
B　[由于生物间存在生殖隔离，细菌感染时并不把遗传物质传递给受感染生物；抗虫基因DXT转移到大白菜细胞中，培育出抗虫效果很好的优质大白菜，说明DXT基因在大白菜细胞中得到了正常表达；在转基因植物培育过程中，载体常用土壤农杆菌的Ti质粒；苏云金杆菌的抗虫基因编码的蛋白质具有毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫的特性，并不能抵抗各种病虫害。]
11．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。据图判断下列操作正确的是(　　)
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
C．目的基因和质粒均用限制酶I切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
A　[由题图信息可知，限制酶Ⅰ只能切割，限制酶Ⅱ不仅能切割，也能切割。据题图可知，目的基因两端都有限制酶Ⅱ的识别序列(切点是)，可见只有用限制酶Ⅱ才能将目的基因切割下来。质粒上Gene Ⅰ和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶Ⅱ的识别序列和限制酶Ⅰ、Ⅱ的识别序列；如果用限制酶Ⅱ切割，则Gene Ⅰ和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留Gene Ⅰ，其产生的黏性末端和切割后目的基因的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA。A正确。]
12．基因治疗通常是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。下列有关基因治疗的叙述，正确的是(　　)
A．基因治疗可以治愈所有的遗传病
B．基因治疗的原理是基因突变
C．经过基因治疗的病人，后代不会再患同种遗传病
D．基因治疗时可以利用经过修饰的病毒作载体
D　[基因治疗只能治疗因基因异常导致的疾病，例如白化病、红绿色盲等，而不能治愈所有的遗传病，A错误；基因治疗的原理是基因重组，B错误；基因治疗的对象是具有致病基因的体细胞，没有涉及原始性细胞，所以其后代仍可能会再患同种基因疾病，C错误；基因治疗要把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中，所以在治疗时可用经过修饰的病毒作载体，D正确。]
13．从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是(　　)
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
C　[紧扣蛋白质工程的流程(基本途径)进行分析。由题可知，多肽P1为抗菌性和溶血性均较强的多肽，要设计出抗菌性强但溶血性弱的多肽，即在P1的基础上设计出自然界原本不存在的蛋白质，用蛋白质工程技术可以实现。蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。故要想在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1的氨基酸序列设计出多条模拟肽，然后进行改造，从而确定抗菌性强但溶血性弱的多肽的氨基酸序列。]
14．下图表示蛋白质工程的操作流程，下列说法不正确的是(　　)
A．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
B．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
C．a、b过程分别表示转录、翻译
D．通过蛋白质工程可制造出一种新的蛋白质
B　[蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，这对于合成或改造基因至关重要，A正确；蛋白质工程的进行离不开基因工程，因为对蛋白质的改造要通过对基因的改造来完成，B错误；图中a、b过程分别表示转录、翻译，C正确；通过蛋白质工程可对现有蛋白质进行改造，也可制造出一种新的蛋白质，D正确。]
15．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(　　)
A．图甲中的质粒用BamH Ⅰ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒和外源DNA
C．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
D．用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性
D　[图甲中的质粒用BamH Ⅰ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能用BamH Ⅰ切割外源DNA，因为BamH Ⅰ会破坏目的基因，B错误；操作中获取目的基因时会用到Pst Ⅰ，但甲中该酶会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用Pst Ⅰ和HindⅢ酶切，可以避免自身环化，保证重组DNA序列的唯一性，D正确。]
二、多项选择题：共5题，每题3分，共15分。每题有不止一个选项符合题意。每题全选对者得3分，选对但不全的得1分，错选或不答的得0分。
16．下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述中，正确的是(　　)
A．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法
B．设计扩增目的基因的引物时，不必考虑表达载体的序列
C．蛋白质工程是通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质的技术
D．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
ACD　[将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法，A项正确；设计引物时应当考虑表达载体的序列，以保证扩增后，目的基因能与切割后的表达载体相连接，B项不正确；蛋白质工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过改造或合成基因来改造现有的蛋白质，或制造一种新的蛋白质的技术，C项正确；通过蛋白质工程可合成自然界不存在的蛋白质，D项正确。]
17．番茄营养丰富，是人们喜爱的蔬菜。普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶的控制基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。科学家通过基因工程将一种抗多聚半乳糖醛酸酶的基因导入番茄细胞，获得了抗软化番茄。下列关于培育抗软化番茄的叙述，正确的是(　　)
A．运载工具可以是质粒
B．受体细胞是番茄细胞
C．目的基因为多聚半乳糖醛酸酶基因
D．目的基因的表达延缓了番茄的软化
ABD　[根据题干信息可知，运载工具可以是Ti质粒，则此时抗软化番茄的培育过程如下：以质粒作为载体，将目的基因(抗多聚半乳糖醛酸酶基因)与质粒结合形成重组DNA，利用含重组DNA的农杆菌去感染普通番茄，使目的基因进入普通番茄细胞中的染色体DNA上，目的基因的表达可抑制多聚半乳糖醛酸酶的作用。]
18．利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，试图培育出耐寒能力强的番茄。下列相关说法正确的是(　　)
A．可用PCR技术获得抗冻蛋白基因
B．将抗冻蛋白基因与相应载体连接构建基因表达载体
C．利用显微注射法将基因表达载体导入受体细胞
D．检测到番茄细胞中具有抗冻蛋白基因，则培育出的番茄一定具有抗寒能力
AB　[基因工程中获取目的基因的方法包括：采用PCR技术体外扩增、人工化学合成(如反转录法)，A正确；在培育耐寒转基因番茄的过程中，需要将抗冻蛋白基因与相应载体连接构建基因表达载体，再导入受体细胞，B正确；将目的基因导入植物受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法，C错误；番茄细胞中具有抗冻蛋白基因，但该基因在受体细胞中不一定表达，因而培育出的番茄不一定具有抗寒能力，D错误。]
19．下图表示利用基因工程生产胰岛素的三种途径，据图判断下列说法正确的是(　　)
A．过程①需要限制酶和DNA连接酶
B．受体细胞A一般选用乳腺细胞
C．受体细胞B通常为莴苣的体细胞
D．三种方法得到的胰岛素结构不完全相同
ACD　[过程①为形成重组质粒的过程，需要限制酶和DNA连接酶，A正确；将目的基因导入动物细胞得到转基因动物时，受体细胞应选择动物的受精卵，B错误；受体细胞B通常是莴苣的体细胞，目的基因导入该细胞后，需对该细胞进行组织培养，形成转基因植株，C正确；大肠杆菌因无内质网、高尔基体等细胞器，无法对核糖体合成的多肽链进行相关加工，形成的胰岛素结构与另外两种方法得到的不同，D正确。]
20．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　　)
A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是用Ca2＋处理细菌
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长
AC　[将基因表达载体导入细菌B之前，一般要先用Ca2＋处理细菌，使之处于感受态，从而能够吸收重组质粒，显微注射法是将目的基因导入动物细胞常用的方法，A正确；质粒A中含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，而重组质粒中抗四环素基因被破坏，只含抗氨苄青霉素基因，则在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入质粒A或重组质粒的细菌，能在含有四环素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌，B错误，C正确；根据题干信息分析，目的基因(人的生长激素基因)成功表达的标志是受体细胞能产生人的生长激素，D错误。]
三、非选择题：共5题，共55分。
21．(11分)科学家利用植物生产药用蛋白，研究出了用转基因马铃薯生产人的血清白蛋白的方法。下图表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两种限制酶在质粒上的切割位点，两种酶识别和切割位点见表。回答相关问题：
限制酶 识别序列和切割位点
EcoR Ⅰ
BamH Ⅰ
(1)该工程中适宜用来切割质粒的限制酶是________，原因是___________
_______________________________________________________________。
(2)利用PCR技术扩增血清白蛋白基因，设计引物序列的主要依据是_____
___________________，还需要在引物的一端加上________序列，以便于后续的剪切和连接。
(3)将目的基因和质粒进行连接后，需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入马铃薯细胞，筛选含有目的基因的细胞需在培养基中添加________。
(4)从含有血清白蛋白基因的马铃薯细胞中提取血清白蛋白，需通过________过程培养到愈伤组织，从其中提取有效成分。
[解析]　(1)限制酶切割质粒时必须保证至少一个标记基因的完整性，若用EcoR Ⅰ切割会将质粒上的两个抗性基因都破坏，故不能选择EcoR Ⅰ切割，只能选择BamH Ⅰ切割目的基因和载体。
(2)PCR扩增的原理是DNA双链复制，需要根据目的(血清白蛋白)基因两端的部分核苷酸序列合成2种引物，还需要在引物一端加上BamH Ⅰ的识别序列GGATCC，以便于后续的剪切和连接。
(3)构建基因表达载体后，首先要把基因表达载体导入农杆菌细胞中，导入之前需要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，然后再让含目的基因的农杆菌去感染马铃薯细胞，进而把目的基因转入马铃薯细胞中，因为基因表达载体中含有抗氨苄青霉素基因，故可以在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选。
(4)马铃薯细胞需要经过脱分化培养至愈伤组织阶段，即可提取细胞产物血清白蛋白。
[答案]　(1)BamH Ⅰ　用EcoR Ⅰ切割会将质粒上的两个抗性基因都破坏　(2)目的(血清白蛋白)基因两端的部分核苷酸序列　GGATCC　(3)Ca2＋　氨苄青霉素　(4)脱分化
22．(11分)(2020·江苏高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；Taq酶的作用是催化____________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′ AACTATGCG┈┈AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG┈┈CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT┈┈TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC┈┈CGAGTAC 3′
[解析]　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)和5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
[答案]　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
23．(10分)某研究小组进行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工作，下图为他们前期研究工作的简要操作流程图，回答下列问题：
(1)实验步骤①所代表的反应过程是____________；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是__________。
(2)步骤②构建基因表达载体A和基因表达载体B必须使用的酶是_______
______________________________________________。
(3)构建基因表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用作基因工程载体的是________；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上________的表达。
[解析]　(1)实验步骤①RNA→DNA所代表的反应过程是逆转录；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是PCR技术(或多聚酶链式反应技术)。
(2)构建基因表达载体时，首先需要限制酶来切割含目的基因的DNA片段以获取目的基因，同时需要用相同的限制酶切割载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和载体，故步骤②构建基因表达载体A和基因表达载体B必须使用的酶是限制酶和DNA连接酶。
(3)构建基因表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用作基因工程载体的是质粒；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上标记基因的表达。
[答案]　(1)逆转录　PCR(或多聚酶链式反应)技术　(2)限制酶和DNA连接酶　(3)质粒　标记基因
24．(11分)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取__________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经______________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是____________________________________________
_____________________________________________________________。
[解析]　(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，T DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
[答案]　(1)mRNA　逆转录酶　PCR　(2)T DNA　整合到叶肉细胞染色体DNA上　(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
25．(12分)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1 GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析]　(1)据图示信息分析：将L1 GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1 GFP融合基因的完整，又能保证L1 GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
[答案]　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞　(4)核DNA
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