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第一节　基因工程及其技术
第1课时　基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术
课标内容要求 核心素养对接
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用，并能说出它们在基因工程中的应用。科学思维：掌握PCR技术的过程与原理，并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。社会责任：通过了解基因工程的发展历程，认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果，并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的
1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
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1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒，同年，科学家发现DNA连接酶。
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1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
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1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
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1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
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接着，科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓
1976年，科学家用质粒为载体，将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌，1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
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1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具
1．基因工程
(1)概念：又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)
(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(2)特点：特异性(专一性)很强。
(3)切割方式
①错位切：在DNA分子两条链的不同部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链，称为黏性末端。
②平切：在DNA分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成平末端。
3．“分子黏合剂”——DNA连接酶
(1)作用：连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键。
(2)类型
①E.coli DNA连接酶：分离自大肠杆菌，可以连接黏性末端的DNA分子。
②T4 DNA连接酶：分离自T4噬菌体，可以连接黏性末端或平末端的DNA分子。
4．“分子搬运工”——载体
(1)作用：将外源基因导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达。
(2)类型：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
(3)组成：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。
(4)改造：基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。
三、聚合酶链式反应(PCR)技术
1．PCR概念：目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。
2．原理：类似于DNA的复制。
3．条件
①模板DNA：DNA的两条链。
②引物对：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③原料：4种dNTP。
④热稳定的DNA聚合酶：Taq酶。
⑤其他：缓冲液、Mg2＋等。
4．过程
(1)变性：在约94_℃高温下，作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。
(2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
(3)延伸：反应体系的温度回升到约72_℃左右，4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物的3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (　　)
[答案]　√
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。 (　　)
×　提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (　　)
[答案]　√
4．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (　　)
×　提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
5．载体的种类有质粒、噬菌体、动物病毒等，其中动物病毒必须是DNA病毒。 (　　)
[答案]　√
6．PCR技术需要热稳定的DNA聚合酶和解旋酶的参与。 (　　)
×　提示：PCR技术中通过加热使双链DNA解旋，不需要解旋酶参与。
7．扩增目的基因时只需要一种引物。 (　　)
×　提示：需两种引物分别与两条母链结合。
　基因工程的工具酶
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系
(1)区别
作用 应用
限制性内切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
(2)两者的关系可表示为
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成
不同点 是否需要模板 不需要 需要
接DNA链 双链 单链
作用过程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键
作用结果 将已存在的DNA片段连接 合成新的DNA分子
用途 基因工程 DNA复制
合作探究：(1)为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
(2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
1.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是(　　)
A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个
B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同
D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物
A　[一个DNA分子中，可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；质粒为小型环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。]
2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
C　[DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。]
3．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是(　　)
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因
D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
C　[限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。]
　基因工程中的载体
1．种类
常用载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的、具有自我复制能力的、很小的双链环状DNA分子。
2．具备条件
(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
3．作用
(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
合作探究：(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：①化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
②功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
(2)标记基因标记的原理是什么？
提示：①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
③结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
原理如图所示：
1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　)
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
A　[作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]
2．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是。下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)
A　　　　　B　　　　C　　　　D
A　[用限制酶Mun Ⅰ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。]
3．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________
_______________________________________________________________；
并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
[解析]　(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
[答案]　(1)能自我复制、具有标记基因　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞
　聚合酶链式反应(PCR)技术
1．PCR反应的过程
2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较
比较项目 PCR技术 DNA复制
区别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外(在PCR扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶(Taq聚合酶) DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件
合成的对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成②原料：均为四种脱氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶进行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
合作探究：(1)PCR过程中为什么需要引物？
提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从子链的3′端催化连接脱氧核苷酸。
(2)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
(3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板
D．四种dNTP为PCR提供能量和原料
B　[通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，同时两个核苷酸连接时可释放能量，D正确。]
2．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　　)
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤　　B．①④⑤　　C．①②⑤　　D．③④
B　[基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶的结合位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。②③正确，①④⑤错误。故选B。]
3．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
[解析]　(1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案]　(1)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键
(2)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
[课堂小结]
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1.基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。2.限制酶的特异性(专一性)很强，能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3.从大肠杆菌分离得到的E.coli DNA 连接酶，可以用于连接具有黏性末端的DNA分子；从T4噬菌体中分离出来的T4 DNA连接酶，可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子。4.质粒载体应该具有的DNA序列包括：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。5.聚合酶链式反应是目的DNA片段的体外扩增技术。包括变性、退火、延伸三个反应步骤。
1．下列对基因工程的说法，错误的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程产生的变异属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
B　[基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，A正确；基因工程属于基因重组，B错误；基因工程可以导入不同种生物的基因，C正确；基因工程可按照人们的意愿，定向改变生物性状，D正确。]
2．(2020·上海高二期末)如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是 (　　)
A．①　　　　B．②　　　　C．③　　　　D．④
B　[限制酶的作用位点是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，即图中②，B正确。]
3．“分子缝合针”——DNA连接酶“缝合”的部位是(　　)
A．碱基对之间的氢键
B．碱基与脱氧核糖
C．双链DNA片段间的磷酸二酯键
D．脱氧核糖与脱氧核糖
C　[相邻的两个脱氧核苷酸之间由磷酸和脱氧核糖形成的磷酸二酯键连接，DNA连接酶连接的是此化学键。]
4．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是(　　)
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
A　[质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。]
5．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是(　　)
A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链
B．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度
C．DNA聚合酶具有耐高温的能力
D．DNA解旋酶具有耐高温的能力
D　[PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。]
6．下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是 (　　)
A．①过程所需的原料是核糖核苷酸
B．②过程所需的酶必须耐高温
C．③过程需要解旋酶破坏氢键
D．④过程的引物对之间不能互补配对
D　[①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。]
17/17课后素养落实(十二)　基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术
(建议用时：40分钟)
题组一　基因工程及其诞生和发展
1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是(　　)
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
D　[该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。]
2．下列关于基因工程的发展历程的说法错误的是(　　)
A．质粒是一种具有自我复制能力的环状DNA分子
B．美国科学家伯格领导的研究小组完成世界上首次DNA分子体外重组
C．科恩和博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中表达
D．基因工程的建立和发展是生物学进步的结果，与其他学科无关
D　[基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等众多学科长足进步的基础上发展而来的。]
题组二　基因工程的基本工具
3．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是(　　)
A．用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
B　[用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为CATG和GATC，不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，也能形成重组质粒，D错误。]
4．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是 (　　)
A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接
B　[DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。]
5．下列关于载体的叙述中，错误的是(　　)
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
C．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
D　[用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成的DNA分子为重组DNA分子，A正确；常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的，B、C正确；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，D错误。]
6．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　)
C　[A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。]
7．根据图表的内容回答问题：
几种限制酶识别序列切割位点
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________、________________、________________。
(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是________、________。
[解析]　(1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoR Ⅰ和1个Pst Ⅰ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因两端和质粒切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。
[答案]　(1)4　质粒载体与质粒载体连接物　目的基因与目的基因连接物　质粒载体与目的基因连接物　(2)EcoRⅠ　SmaⅠ
题组三　PCR技术
8．DNA的复制需要引物，主要原因是(　　)
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
D　[DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。]
9．利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因的前提是(　　)
A．有目的基因的DNA片段，作为模板进行复制
B．有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物
C．有足够的脱氧核苷酸作为原料
D．加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增
B　[利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。]
10．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
[解析]　(1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便基因与载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性内切核酸酶的切割位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。
(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板碱基配对。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。
[答案]　(1)逆转录　cDNA　(2)限制性内切核酸酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)②③
11．对下图所示黏性末端的相关说法错误的是(　　)
A．甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性内切核酸酶催化产生的
B．甲、乙具相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C．DNA连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D．切割甲的限制性内切核酸酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
C　[甲图表示在G和A之间进行剪切，乙图表示在C和A之间进行剪切，丙图表示在C和T之间进行剪切，因此三者需要不同的限制性内切核酸酶进行剪切；甲和乙的黏性末端相同，能够通过碱基互补配对形成重组DNA分子，但甲和丙不行；DNA连接酶作用的位点是磷酸二酯键，乙图中的a和b分别表示磷酸二酯键和氢键；甲和乙形成的重组DNA分子相应位置的DNA碱基序列为，而甲图表示在G和A之间切割，所以该重组序列不能被切割甲的限制性内切核酸酶识别。]
12．下图所示为限制酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ的识别序列及切割位点，实验中用BamH Ⅰ切割DNA获得目的基因，用Bgl Ⅱ切割质粒，并将它们拼接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是(　　)
A．在酶切过程中，只需要控制好酶的浓度，不需要控制温度等因素
B．经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
C．质粒经Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是
D．分别用图中两种限制酶切割，可保证目的基因定向地插入质粒
B　[影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度、反应时间等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶识别，B正确；质粒经Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是，C错误；分别用题图中两种限制酶切割目的基因和质粒，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向地插入质粒，D错误。]
13．RT PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑表达载体的序列
B．GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
D．过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n－1个引物B
C　[设计扩增目的基因的引物时，引物应当可以与表达载体两端的序列进行互补配对。所以设计引物时需考虑表达载体的序列，A正确；GC对之间有三个氢键，GC含量高时稳定性高，所以需要更高的温度，B正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，C错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA的半保留复制可知理论上需要2n－1个引物B，D正确。]
14．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于____________________________。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端。_____________________________________________________。
(3)pBR322分子中另有单个的BamH Ⅰ限制酶作用位点，现将经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复____________键，成功地获得了重组质粒，这说明_________________
____________________________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是____________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________。
[解析]　(1)构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。(2)EcoR Ⅰ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。(3)DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干可知，两种限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。(4)与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是能抗氨苄青霉素和四环素的人工质粒即pBR322质粒。
[答案]　(1)重组DNA的鉴定和筛选(鉴别目的基因是否导入受体细胞)
(2)
(3)磷酸二酯　两种限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素　pBR322质粒
对限制酶的作用结果分辨不清
15．表1列举了几种限制酶识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。图2是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　)
表1
图2
A．BamH Ⅰ切割的是磷酸二酯键，Alu Ⅰ切割的是氢键
B．能被Sau3A Ⅰ识别的序列，一定也能被BamH Ⅰ识别
C．DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④
D．E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③
C　[BamH Ⅰ与Alu Ⅰ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamH Ⅰ识别并切割，Sau3A Ⅰ识别并切割，故BamH Ⅰ能识别的碱基序列，Sau3A Ⅰ一定能识别，但是Sau3A Ⅰ能识别的序列，BamH Ⅰ不一定能识别，B错误；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C正确；E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③均属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。]
8/9课后素养落实(十三)　基因工程的基本操作程序
(建议用时：40分钟)
题组一　目的基因的获取与基因表达载体的构建
1．下列不属于获取目的基因的方法是(　　)
A．从基因文库中提取
B．利用PCR技术合成
C．利用DNA转录合成
D．利用化学方法人工合成
C　[可以从基因组文库中获取目的基因，A正确；可以利用PCR技术扩增目的基因，B正确；利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C错误；可以利用化学方法人工合成目的基因，D正确。]
2．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　　)
A．基因表达载体的构建方法不完全相同
B．有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
C．终止子的作用是终止翻译过程
D．基因表达载体的结构包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等
C　[因为受体细胞有植物、动物、微生物之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建方法是不完全相同的，A正确；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质，B正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，终止密码子的作用是使翻译在所需要的地方停止，C错误；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，D正确。]
3.CTB是霍乱弧菌产生的肠毒素(蛋白质)结构的一部分，可用作针对霍乱弧菌的疫苗。研究人员提取了控制CTB合成的基因(ctb)，构建基因表达载体(如图所示)，将其导入番茄，然后用转基因番茄饲喂试验小鼠，检测疫苗的有效性。请回答相关问题：
(1)为了在短时间内获得大量基因，可以采用________技术。与细胞内DNA复制时的解旋过程相比，该技术的DNA解链过程有何不同？_____________(写出一点即可。)
(2)使用两种限制酶切割载体可防止切开的载体的两个末端重新连接起来，原因是_____________________________________________________。
(3)可采用________法将基因表达载体导入番茄细胞，然后在加入了________的培养基中进行初步筛选，之后还需用________技术检测ctb基因是否整合到番茄染色体的DNA上。
(4)提取转基因番茄不同部位的蛋白质进行检测，发现只有果实中含有CTB。ctb基因只能在果实细胞中表达，这与基因表达载体中的________有关。
(5)用转基因番茄果实饲喂试验小鼠，若能在小鼠的血清中检测到________，则说明该转基因疫苗是有效的。
[答案]　(1)PCR　不需要解旋酶　(2)两种限制酶切割载体可以产生不同的末端　(3)农杆菌转化　卡那霉素　DNA分子杂交　(4)E8启动子　(5)CTB抗体
题组二　将目的基因导入受体细胞及相关检测与鉴定
4．(多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是(　　)
A．将毒素蛋白注射到棉受精卵中
B．将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
C．将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养
D．将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵
CD　[将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中，棉受精卵没有获得目的基因，发育成的植株不会有抗虫性状，A错误；将编码毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉受精卵中，而没有将目的基因与运载体结合，目的基因将不能稳定存在，很容易被水解，不能培养出抗虫棉，B错误；C项所述为用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，C正确；当受体细胞是植物细胞时，还可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中，然后发育为转基因植株，D项所描述的类似于花粉管通道法，D正确。所以选CD。]
5．下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是(　　)
A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少
B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
D　[由于原核生物具有繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少等特点，所以早期的基因工程通常都用原核生物作为受体细胞；受体细胞经Ca2＋处理后，处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，称为感受态；感受态细胞吸收DNA分子需要在适宜的温度和酸碱度的缓冲液中完成。]
6．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是(　　)
①检测受体细胞中是否有目的基因
②检测受体细胞中是否有致病基因
③检测目的基因是否转录出了mRNA
④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A．①②③ 　　　　 B．②③④
C．①③④ D．①②④
C　[目的基因的分子检测包括三个方面：①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了相应的mRNA，方法是使用基因探针与之杂交；③检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，常用的方法是抗原—抗体杂交。]
7．基因工程中，受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题：
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入________细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌________质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染____________植物。农杆菌侵染植物，能够将目的基因插入植物细胞的________________上。
(2)将重组质粒导入动物细胞，常采用________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用________处理大肠杆菌，使较多的细胞成为________细胞以利于表达载体的进入。
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的________(变异类型)。
[解析]　(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染单子叶植物。农杆菌侵染植物后，能够将Ti质粒上的T DNA携带的目的基因插入植物细胞的染色体DNA上。
(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用Ca2＋处理大肠杆菌，使较多的细胞成为感受态细胞以利于表达载体的进入。
(3)基因工程的原理为基因重组。
[答案]　(1)植物　Ti　单子叶　染色体DNA
(2)显微注射　Ca2＋　感受态
(3)基因重组
题组三　DNA的粗提取与鉴定
8．下列关于DNA的粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．2 mol·L－1的NaCl溶液可用来粗提取DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
A　[兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B正确；DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度较高，可用来溶解DNA，C正确；将析出的DNA溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才会呈现蓝色，D正确。]
9．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于 DNA 的粗提取
B．植物材料的细胞壁不影响DNA的粗提取
C．DNA易溶于 2 mol·L－1 的 NaCl 溶液中
D．溶有 DNA 的 NaCl 溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
C　[猪是哺乳动物，其红细胞没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；细胞壁会对DNA的粗提取造成一定的阻碍，B错误；DNA可溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，C正确；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察颜色(呈蓝色)，D错误。]
10．如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。已知DNA在0.14 mol·L－1的氯化钠中溶解度最低；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。回答下列问题：
(1)通过上述步骤得到滤液C后，向滤液中加入2 mol·L－1的NaCl溶液的目的是________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是__________________。
(2)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定量杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，则含DNA最少的是滤液________，原因是_________________________________
______________________________________________________________。
序号 溶液 操作 滤液
1 图中B的溶液 研磨搅拌后过滤 E
2 2 mol·L－1 NaCl溶液 搅拌后过滤 F
3 0.14 mol·L－1 NaCl溶液 搅拌后过滤 G
4 冷却的95%的酒精溶液 搅拌后过滤 H
(3)DNA鉴定的原理是___________________________________________。
[解析]　(1)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol·L－1的NaCl溶液，溶解DNA，过滤除去不溶于NaCl的杂质；向滤液D中加入蒸馏水的目的是降低DNA的溶解度，有利于DNA析出。
(2)由于DNA可以溶于氯化钠溶液中，在2 mol·L－1的氯化钠溶液中DNA的溶解度较高，搅拌过滤后，DNA存在于得到的滤液中；DNA在0.14 mol·L－1的氯化钠溶液中溶解度最低，此时DNA会从溶液中析出，搅拌过滤后，得到的黏稠物主要就是DNA，滤液只含有少量DNA；由于DNA不溶于酒精，而其他杂质可以溶于酒精，因此放入冷却的95%的酒精溶液中，DNA不溶于酒精，搅拌过滤后，DNA存在于黏稠物中，滤液中几乎不含DNA，因此含DNA最少的是滤液H。
(3)DNA鉴定的原理：在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
[答案]　(1)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出　(2)H　DNA不溶于酒精　(3)在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色
11．抗菌肽对治疗癌症有一定的作用，下图表示抗菌肽合成过程。相关说法正确的是(　　)
A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码和终止密码
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
A　[PCR技术中采用高温变性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶；基因表达载体包括启动子和终止子，起始密码和终止密码在mRNA上；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质。]
12．番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列描述正确的是(　　)
A．用限制性内切核酸酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B．用Ca2＋处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入
C．重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D．若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米
C　[目的基因是用限制性内切核酸酶将DNA酶切后得到的，需筛选；Ca2＋用于处理细菌细胞；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。]
13．大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β 半乳糖苷酶。当培养基中含有IPTG和X gal时，X gal便会被β 半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答下列问题：
(1)对已获得的目的基因可利用________技术进行扩增。
(2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复________键。
(3)将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是________；大肠杆菌需事先用Ca2＋进行处理，目的是____________________________________
______________________________________________________________。
(4)将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质____________________________和生长因子，还应加入IPTG、X gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出________________________________。
(5)若观察到培养基上出现________色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是___________________________________________________
_____________________________________________________________。
[答案]　(1)PCR　(2)磷酸二酯　(3)进行转化　使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　(4)碳源、氮源、无机盐、水　导入pUC18质粒和重组质粒的大肠杆菌　(5)白　无论大肠杆菌中是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落，无法判断导入的是原pUC18质粒还是重组质粒
混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子
14．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　)
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
C　[由于基因的选择性表达，在人的肝细胞中没有胰岛素基因转录的mRNA，所以表达载体中的胰岛素基因不能通过人肝细胞mRNA逆转录获得，A错误；表达载体的复制启动于复制原(起)点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确；启动子在胰岛素基因的转录过程中起作用，终止密码子在胰岛素基因的翻译过程中起作用，D错误。]
8/8第2课时　基因工程的基本操作程序
课标内容要求 核心素养对接
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 科学思维：结合生产实例，说出基因工程的基本操作程序。科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，小组合作探究，尝试提出初步的基因工程构想，完成框架设计。
一、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接人工合成目的基因
①对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。
②全基因或较大基因，使用半合成的方法可以降低成本。
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库：是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝，整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因。
筛选方法：一般采用核酸探针杂交的方法。
②cDNA文库：从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
特点：含有某种生物的部分基因。
2．基因表达载体的构建
(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，还要能稳定存在且遗传给后代。
(2)基因表达载体的构成：目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因等。
3．将目的基因导入受体细胞
(1)将目的基因导入植物细胞
①方法：主要是农杆菌转化法。
②原理：双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA(T DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。
③过程
将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T DNA特定区段上→转入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→目的基因稳定的遗传和表达
(2)将目的基因导入动物细胞
①主要方法：显微注射法。
②操作对象：受精卵。
③其他方法：也可用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞。
(3)将目的基因导入微生物细胞
①方法：感受态细胞法。
②原理：经过适当处理(Ca2＋处理)后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA。
③过程
CaCl2溶液处理大肠杆菌→感受态细胞→重组的基因表达载体与感受态细胞混合→转化→培养→筛选含目的基因的微生物
4．目的基因及其表达产物的检测鉴定
(1)从DNA方面进行检测
①方法：DNA分子杂交法。
②基因探针：用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。
③原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下可以按照碱基互补配对原则形成双链。
(2)从RNA方面检测受体细胞
①方法：分子杂交技术。
②操作：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，观察是否出现杂交带。
(3)从蛋白质方面进行检测
①方法：抗原—抗体杂交。
②操作：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，观察是否出现杂交带。
(4)从个体水平进行鉴定：检测转基因生物是否表现出目的基因控制的性状。
二、DNA的粗提取和鉴定
1．DNA的粗提取
2．DNA的鉴定
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．基因组文库含有某种生物体全部基因片段，cDNA文库只包含某种生物体一部分的基因片段。 (　　)
[答案]　√
2．一般可采用猪血进行DNA的粗提取。 (　　)
×　提示：哺乳动物血液中DNA含量较低，不适宜作为DNA粗提取的材料。
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。
(　　)
×　提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 (　　)
[答案]　√
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 (　　)
×　提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
6．可通过DNA分子杂交技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。 (　　)
[答案]　√
　基因表达载体的构建
1．基因表达载体的构建过程
(1)用同一种限制酶或产生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和质粒，使其产生相同末端。
(2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：
2．限制酶的选择策略
甲　　　　　　　　　乙
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。
(3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
合作探究：(1)如何区分启动子、终止子、起始密码子和终止密码子？
提示：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
(2)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
图1
图2
①构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ酶切割质粒？为什么？
提示：不能；因为Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
②与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
1．在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要 (　　)
①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶　③RNA聚合酶
④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸
A．③⑥ B．②④　　　
C．①⑤　　　 D．①②④
A　[构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。]
2．下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是(　　)
A．切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶
B．抗虫基因表达载体中要有起始密码子
C．抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞
D．抗虫基因的表达开始于复制原点
C　[切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误；抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，起始密码子位于mRNA上，B项错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确；抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。]
3．图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(　　)
图甲
图乙
A．用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma Ⅰ切割
B．图甲所示的质粒分子在经Sma Ⅰ酶切割后含有4个游离的磷酸基团
C．为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶
D．用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
A　[据图分析，质粒中，Sma Ⅰ的切割位点位于标记基因(抗生素抗性基因)上，在外源DNA分子中，Sma Ⅰ的切割位点位于目的基因上，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma Ⅰ切割，A正确；图甲所示的质粒分子只有一个Sma Ⅰ切割位点，所以在经Sma Ⅰ酶切割后含有2个游离的磷酸基团，B错误；为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，C错误；只使用EcoR Ⅰ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH Ⅰ或HindⅢ剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割目的基因，D错误。]
　将目的基因导入受体细胞
1．目的基因导入受体细胞的方法
受体细胞类型 方法 说明 特点
植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物细胞 显微注射技术　　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物细胞 Ca2＋处理法(感受态细胞法) 用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效
2．农杆菌转化法分析
(1)构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。
(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
(3)由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。
合作探究：(1)农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
(2)将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
1．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是(　　)
A．培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
A　[水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]
2．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是______________________________，需用________“缝合”双链DNA片段的平末端。
(2)目的基因是指________________。由过程②形成的基因表达载体中，目的基因的上游具有________，它是________识别和结合的部位。
(3)过程③常用________处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是________________________________。
(4)可通过________技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。
[解析]　(1)Ti质粒有多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。
(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的首端具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。
(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。
(4)检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用DNA分子杂交技术。
[答案]　(1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列T4 DNA连接酶
(2)编码蛋白质的基因　启动子　RNA聚合酶
(3)Ca2＋(CaCl2溶液)　鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌
(4)DNA分子杂交
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。2.基因组文库是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后，转化宿主，这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。3.构建基因表达载体不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达，还要能稳定存在且遗传给后代。基因表达载体除了目的基因外，还应该包括复制原点、启动子、终止子和标记基因等。4.农杆菌Ti质粒上的可转移DNA(T DNA)能进入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上。5.基因导入受体后，能否有效表达需从DNA方面、RNA方面、蛋白质方面、个体水平对生物的特定性状进行筛选和鉴定。6.在酸性条件下，DNA与二苯胺发生反应，溶液呈蓝色。
1．基因工程主要操作步骤的顺序是(　　)
①基因表达载体的构建　②将目的基因导入受体细胞　③目的基因及其表达产物的检测与鉴定　④目的基因的获取
A．③②④①　B．②④①③　C．④①②③　D．③④①②
C　[基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因及其表达产物的检测和鉴定。]
2．右图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是(　　)
A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的
B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
B　[由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。]
3．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　)
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
D　[重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，DNA聚合酶一般用于DNA复制过程，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；如果受体细胞的染色体上含抗虫基因，只能说明抗虫基因成功整合到受体细胞的染色体上，不代表该基因就一定能表达成功，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。]
4．利用外源基因在受体细胞中表达可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是(　　)
A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
B．山羊乳腺细胞中检测到人的生长激素基因
C．大肠杆菌中检测到人的胰岛素基因转录出的mRNA
D．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
D　[目的基因完成表达是指目的基因在细胞中合成相应的蛋白质，在酵母菌细胞中提取到人的干扰素，说明导入酵母菌中的人的干扰素基因完成了表达。]
5．下列关于DNA粗提取与鉴定说法错误的是(　　)
A．柠檬酸钠溶液可防止血液凝固
B．加蒸馏水是为了让鸡血细胞破裂
C．在2 mol·L－1 NaCl溶液中DNA会析出
D．酸性条件下二苯胺与DNA反应呈蓝色
C　[在2 mol·L－1 NaCl溶液中，DNA溶解度较高，不会析出，C错误。]
6．下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。
据图回答：
(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为________。
(4)在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。
[答案]　(1)逆转录　DNA聚合酶　氨基酸　脱氧核苷酸　(2)引物　模板(A基因)　(3)基因表达载体　(4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
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