资源简介

2.1基因工程的基本操作程序
学习目标
1、概括基因工程的原理和基本操作程序。
2、阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程。
3、列举将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法。
4、针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
基础梳理
（一）目的基因的筛选与获取
1. 概念：用于改变___________________或获得____________________等的基因。
2. 实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是____________________。
3. 筛选合适的目的基因
（1）较为有效的方法：从相关的__________________和________________的基因中进行筛选。
（2）实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物___________________有了较为深入的了解。
（3）认识基因结构和功能的技术方法：____________________技术、遗传序列数据库、_______________________工具。
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的含义：PCR是______________________的缩写，它是一项根据______________
________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_____________
_____________________进行大量复制的技术。
（2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种______________、四种_____________
_______、______________________________。
（3）引物是一小段能与________________的一段碱基序列________________的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~ 30个核苷酸。
（4）PCR反应的过程：
①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA_______________________________。
②复性：温度下降到50 ℃左右时，_________________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③温度上升到72 ℃左右时，溶液中_________________在耐高温的_____________________
_________________的作用下加到引物的________端合成子链。
④重复循环多次。
（二）基因表达载体的构建
1. 基因表达载体是载体的一种，除______________、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。
2. 启动子是一段有特殊序列结构的_______________，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
3. 终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的_________________。
4. 过程：首先用一定的__________________切割载体，使它出现一个切口，然后用_______________限制酶或_______________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用______________________将目的基因片段拼接到载体的切口处。
（三）将目的基因导入受体细胞
1. 转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内___________和_________________的过程。
2. 目的基因导入受体细胞的方法
（1）将目的基因导入植物细胞的方法有________________、_________________等。
（2）将目的基因导入动物受精卵的常用方法有_____________等。
（3）将目的基因导入大肠杆菌的方法：用__________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
（四）目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
（1）通过_________________等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
（2）从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__________________杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2. 个体水平的鉴定
随堂训练
1.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因
③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A.①②③④ B.①②③ C.①②④ D.②③
2.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( )
A.需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 B.反应过程包括变性→复性→延伸
C.95℃时DNA的磷酸二酯键断开 D.引物与模板结合后向5′端方向延伸DNA链
3.下列关于基因表达载体的说法不正确的是( )
A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C.终止子位于目的基因的尾端，能够终止翻译过程
D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
4.科研人员通过PCR技术获得肝细胞特异性启动子——白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建表达载体，培育出在肝细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述正确的是( )
A.将该表达载体导入肝细胞以获得转基因小鼠
B.利用PCR技术获得白蛋白启动子需设计特异性的引物
C.构建该表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
D.通过核酸分子杂交技术检测目的基因是否完成表达
5.利用农杆菌转化法，将含有基因修饰系统的T-DNA插入到水稻细胞M的某条染色体上，在该修饰系统的作用下，一个DNA分子单链上的一个C脱去氨基变为U，脱氨基过程在细胞M中只发生一次。将细胞M培育成植株N。下列说法错误的是( )
A.N的每一个细胞中都含有T-DNA
B.N自交，子一代中含T-DNA的植株占3/4
C.M经n（n≥1）次有丝分裂后，脱氨基位点为A—U的细胞占1/2n
D.M经3次有丝分裂后，含T-DNA且脱氨基位点为A—T的细胞占1/2
6.土壤农杆菌中含有Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，Ti质粒上的T-DNA片段可整合到植物细胞中的染色体DNA上。若想用基因工程手段获取抗旱植株，以下分析不合理的是( )
A.若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内
B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以先用钙离子处理农杆菌
C.用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞后，可通过植物组织培养技术得到具有抗旱基因的植物
D.若能在植物细胞中检测到抗旱基因，则说明该基因工程项目获得成功
7.导致新冠肺炎的病原体是“2019—nCoV”病毒，该病毒为RNA病毒，其序列中具有RNA聚合酶基因，无逆转录酶基因。快速准确的检测对疫情防控起着至关重要的作用。病毒的检测方法有：①用“新冠病毒核酸检测试剂盒”，检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。下列有关说法不正确的是( )
A.方法①②③都需要从患者体内采集病毒样本
B.方法②③都需要用到抗原—抗体杂交的方法
C.某人有可能①②为阳性③为阴性，也可能③为阳性①②为阴性
D.由于RNA相比DNA稳定性差，往往将病毒样本的RNA反转录成cDNA，扩增之后进行分段测序，在该过程中需要用到的酶有逆转录酶、DNA聚合酶
答案
1.答案：D
解析：从基因文库中获取目的基因不需要模板链，①错误；利用PCR技术扩增目的基因需要模板链，②正确；反转录法合成目的基因需要模板链，③正确；通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因不需要模板链，④错误。故D正确。
2.答案：B
解析：PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，A错误；反应过程包括变性→复性→延伸，B正确；95 ℃时DNA双链间的氢键断开，C错误；引物与模板结合后向引物的3′端方向延伸DNA链，D错误。
3.答案：C
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包含启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确、C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
4.答案：B
解析：将表达载体导入肝细胞无法获得转基因小鼠个体，应将表达载体导入受精卵，后者可以发育成新的个体，A选项错误；根据碱基互补配对原则，需设计特异性引物才能通过PCR获得白蛋白启动子，B选项正确；构建该表达载体需要限制酶和DNA链接酶，不需要DNA聚合酶，C选项错误；通过核酸分子杂交技术只能检测目的基因是否转入(运用DNA—DNA分子杂交技术)以及目的基因是否转录(运用DNA—RNA 分子杂交技术)，检测是否表达，是要检测蛋白质，需要用抗原—抗体杂交技术，D选项错误。
5.答案：D
解析：植株N是由细胞M形成的，在形成过程中没有DNA的丢失，由于T-DNA插入到水稻细胞M的某条染色体上，所以细胞M含有T-DNA，因此植株N的每一个细胞中都含有T-DNA，A项正确。植株N的一条染色体中含有T-DNA，可以记为+，因此植株N的基因型记为+-，若自交，则子代中相关的基因型为++：+-：--=1:2:1，有3/4的植株含T-DNA，B项正确。细胞M中只有1个DNA分子的单链上的一个C脱去氨基变为U，所以复制n次后，产生的子细胞有2n个，但脱氨基位点为A—U的细胞的只有1个，所以这种细胞的比例为1/2n，C项正确。细胞M经3次有丝分裂后，形成的子细胞有8个，由于细胞M的DNA分子单链上的一个C脱去氨基变为U，所以是G和U配对，复制3次后，有4个细胞脱氨基位点为C—G，3个细胞脱氨基位点为A—T，1个细胞脱氨基位点为U—A，因此含T-DNA且脱氨基位点为A—T的细胞占3/8，D项错误。
6.答案：D
解析：土壤农杆菌中含有Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，Ti质粒上的T-DNA片段可整合到植物细胞中的染色体DNA上，所以若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，A正确；将重组Ti质粒导入土壤农杆菌时，可先用钙离子处理农杆菌，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，使其具有抗旱基因，然后再通过植物组织培养技术将受体细胞培养成具有抗旱基因的植物，C正确；能够在植物细胞中检测到抗旱基因，只能说明目的基因导入成功，不能说明该基因成功表达，即不能说明该基因工程项目获得成功，D错误。
7.答案：A
解析：2019—nCoV病毒为RNA病毒，具有RNA聚合酶基因，无逆转录基因，其RNA首先侵入机体，然后经过复制过程并指导相关蛋白质合成，进而完成病毒自身的增殖过程，同时杋体产生相应的抗体，抗体的产生的快慢可能会因人而异，据此推测：RNA检测和抗原蛋白检测需要从患者体内采集病毒样本，而检测抗体不需要采集病毒样本，A错误；方法②③都是检测蛋白质，都需要用到抗原一抗体杂交的方法，B正确；某人有可能①②为阳性③为阴性，即感染了新冠病毒但还未产生抗体，也可能③为阳性①②为阴性，即抗体阳性，因感染该病毒但痊愈或注射疫苗产生了抗体，C正确；由于RNA相比DNA稳定性差，往往将病毒样本的RNA反转录成cDNA，该过程中需要用到的酶有逆转录酶、DNA聚合酶，D正确。

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