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高中生物研究—科学方法(2)
一、差速离心法与密度梯度离心法
1．差速离心法
(1)概念：差速离心主要是采取逐渐提高离心速率分离不同大小颗粒的方法。
(2)原理：在分离细胞中的细胞器时，将细胞膜破坏后，形成由各种细胞器和细胞中其他物质组成的匀浆，将匀浆放入离心管中，采取逐渐提高离心速率的方法分离不同大小的细胞器。
(3)具体操作：起始的离心速率较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速率离心上清液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
2．密度梯度离心法
(1)概念：密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。
(2)原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
(3)操作：离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离，组分以区带层分布于梯度柱中。
3．密度梯度离心法和差速离心法的区别
(1)差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离，密度梯度离心中单一样品组分的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
(2)差速离心用两个甚至更多的转速，而密度梯度离心只用一个离心转速。
(3)差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分，而密度梯度离心的物质是密度有一定差异的。
二、同位素标记法与荧光标记法
1．同位素标记法
(1)同位素：同一元素中，质子数相同、中子数不同的原子互为同位素。
常用的同位素有：具有放射性的同位素：14C、32P、3H、35S等；还有不具有放射性的同位素：15N、18O等。
(2)同位素的特点：物理性质可能有差异，但组成的化合物化学性质相同。
(3)同位素标记法
①概念：用物理性质特殊的同位素标记特定的原子，追踪化学反应中特定原子的去向。
②应用方法：标记特征化合物作为反应的原料，检测特征元素的去向，从而探究生化反应过程。
③教材实例：
稳定性同位素标记(15N、18O) 放射性同位素标记(14C、32P、3H、35S)
①鲁宾和卡门利用O的稳定性同位素18O，研究发现光合作用的氧气来源于水。(必修1 P102)
②利用N的稳定性同位素15N，证明了DNA的半保留复制。(必修2 P53) ①利用放射性同位素3H研究分泌蛋白的合成和运输。(必修1 P51)
②卡尔文利用放射性同位素14C发现了光合作用中的卡尔文循环。(必修1 P104)
③利用放射性同位素32P标记DNA,35S标记蛋白质，证明了T2噬菌体的遗传物质是DNA。(必修2 P44)
2.荧光标记法
生物材料荧光标记，就是一种生物材料可以发出荧光，那么就可以用它与另外一种物质结合在一起，因为它可以发出荧光，可以根据荧光出现的位置和亮度看另外一种物质所在的位置或者那种物质有多少。
3．同位素标记技术与荧光标记技术的区别
同位素标记技术，标记的是元素，可出现在不同化合物中，不会消失；荧光标记技术一般标记的是某种特定生物大分子，该分子分解则无荧光显现；两者均可用相关仪器检测追踪。
1．“工欲善其事，必先利其器”。科学的研究方法是科研工作顺利开展的重要保障，下列研究方法对应错误的是(　　)
A．分离细胞器利用了差速离心法
B．研究分泌蛋白的合成与分泌，利用了同位素标记法
C．研究动物细胞融合，利用了同位素标记法
D．证明DNA的半保留复制，利用了密度梯度离心法和同位素示踪技术
C
解析：用差速离心法能分离不同的细胞器，A项正确。用3H标记的亮氨酸可研究分泌蛋白的合成和分泌过程，该方法为同位素标记法，B项正确。研究动物细胞融合过程中细胞膜的流动，用的是荧光标记技术，C项错误。科学家用15N标记的15NH4Cl培养液来培养大肠杆菌，让大肠杆菌繁殖几代，再将大肠杆菌转移到14N的普通培养液中。然后，在不同时刻收集大肠杆菌并提取DNA进行密度梯度离心，记录离心后试管中DNA的位置，证明了DNA的复制是以半保留的方式进行的，该过程利用了同位素示踪技术和密度梯度离心法，D项正确。
2．下列经典实验与所用方法的对应关系，错误的是(　　)
A．小鼠细胞和人细胞融合实验——荧光标记法
B．探究光合作用释放的O2的物质来源——同位素标记法
C．研究种群数量的变化趋势——模型建构法
D．DNA复制方式的证实——差速离心法
D
解析：小鼠细胞和人细胞融合实验中应用了荧光标记法，A正确；鲁宾和卡门用18O标记水，证明光合作用所释放的氧气全部来自水，B正确；研究种群数量的变化趋势应用了模型建构法，C正确；DNA的复制为半保留复制，该结论是通过密度梯度离心的方法得出的，D错误。
3．观察细胞器的亚显微结构使用的工具和分离细胞器常用的方法分别是(　　)
A．光学显微镜、同位素标记法
B．电子显微镜、同位素标记法
C．放大镜、差速离心法
D．电子显微镜、差速离心法
D
解析：光学显微镜下观察到的为显微结构，同位素标记法用于标记化学元素的来源去向；观察亚显微结构使用的工具是电子显微镜，分离细胞器常用的方法为差速离心法。
4．(2021·适应性测试重庆卷)同位素标记法可用于研究物质的组成。以下各组物质中，均能用15N标记的是(　　)
A．核糖核酸和氨基酸
B．脂肪和脱氧核糖核酸
C．葡萄糖和氨基酸
D．脱氧核糖核酸和淀粉
A
解析：核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的组成元素为C、H、O、N、P，氨基酸的组成元素为C、H、O、N，脂肪、葡萄糖和淀粉只含C、H、O。A选项中核糖核酸和氨基酸都含有N，均能用15N标记，A正确。
5．(多选) (2022·湖北荆门期中)研究叶肉细胞的结构和功能时，取匀浆或上清液依次离心将不同的结构分开，其过程和结果如图所示，P1～P4表示沉淀物，S1～S4表示上清液。
据此分析，下列叙述不正确的是(　　 )
A．图中分离细胞器的方法为差速离心
B．上图中包含DNA的是P1、P2和P3
C．P1、P2、P3、P4和S3均能合成相应的蛋白质
D．S1、S2、S3和P4中均有膜结构的细胞器
BCD
解析：据图分析各个部分中所含有的细胞器或细胞结构：P1为细胞核、细胞壁碎片，S1为细胞器和细胞质基质；S2为除叶绿体之外的细胞器和细胞质基质，P2为叶绿体；S3为除叶绿体、线粒体之外的细胞器和细胞质基质，P3为线粒体；S4为除叶绿体、线粒体、核糖体之外的细胞器和细胞质基质，P4为核糖体；S1包括S2和P2；S2包括S3和P3；S3包括S4和P4。图中分离细胞器的方法为差速离心，A正确。DNA存在于细胞核、线粒体和叶绿体中，因此图中存在DNA的有S1、P1、S2、P2和P3，B错误。蛋白质的合成场所为核糖体，线粒体和叶绿体中也含有核糖体，所以P2、P3、P4、S1、S2和S3均能合成相应的蛋白质，但是P1不能合成蛋白质，C错误。P4核糖体没有膜结构，D错误。
6．(2020·全国Ⅱ卷)为了研究细胞器的功能，某同学将正常叶片置于适量的溶液B中，用组织捣碎机破碎细胞，再用差速离心法分离细胞器。回答下列问题：
(1)该实验所用溶液B应满足的条件是______________________________
____________________(答出2点即可)。
(2)离心沉淀出细胞核后，上清液在适宜条件下能将葡萄糖彻底分解，原因是此上清液中含有__________________________。
pH应与细胞质基质的相同，渗透
压应与细胞内的相同
细胞质基质组分和线粒体
解析：(1)实验所用的溶液B应与细胞器所处的液体环境类似，故其pH、渗透压等条件应与细胞质基质基本相同。(2)离心后的上清液在适宜条件下能将葡萄糖彻底分解，即能完成叶肉细胞中有氧呼吸的全过程，原因是此上清液中含有细胞质基质的组分和线粒体。
(3)将分离得到的叶绿体悬浮在适宜溶液中，照光后有氧气释放；如果在该适宜溶液中将叶绿体外表的双层膜破裂后再照光，_____(填“有”或“没有”)氧气释放，原因是_____________________________________
_____________________________________。
有
类囊体薄膜是H2O分解释放O2的场所，
叶绿体膜破裂不影响类囊体膜的功能
解析：(3)光合作用过程中，叶绿体中释放O2的部位是类囊体薄膜，类囊体薄膜上含有的色素能吸收光能，在酶的作用下，使H2O在光下分解产生O2。叶绿体膜破裂不影响类囊体薄膜的功能，在该适宜溶液中将叶绿体外表的双层膜破裂后再照光，仍有O2释放。
7．如图为细胞结构示意图，甲～己为细胞内结构，①～⑨为物质运输过程。据图回答问题。
(1)溶酶体中的多种水解酶是在结构[乙]_______________________上合成的，为了研究水解酶从合成到进入溶酶体的途径，可采用____________法，据图预测水解酶从合成到进入溶酶体的过程：____________→溶酶体(用图中的甲、乙、丙、丁、戊、己和箭头表示)。
(2)图中过程⑥→⑨说明溶酶体具有________________________的功能，溶酶体的功能说明其膜的结构特点是___________________。
(3)为了研究细胞核内的蛋白质是由细胞质基质中的核糖体合成，并通过核孔进入的，请写出用酵母菌作为实验材料的实验设计思路：________
______________________________________________________________。
附着在内质网上的核糖体
同位素标记　
乙→甲→丁
分解衰老、损伤的细胞器
具有一定的流动性
中注射放射性同位素标记的氨基酸，观察放射性标记的物质转移情况
向酵母菌
解析：(1)结构[乙]是附着在内质网上的核糖体；研究物质合成转移的方式采用同位素标记法，水解酶首先由附着在内质网上的核糖体合成，然后进入内质网进行初步加工，再进入高尔基体进行再加工，最后通过囊泡运输到溶酶体内，因此其从合成到进入溶酶体的途径是乙→甲→丁→溶酶体。(2)图中过程⑥→⑨说明溶酶体具有分解衰老、损伤的细胞器的功能；生物膜的结构特点是具有一定的流动性。(3)研究物质的转移情况选择放射性同位素标记法。

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