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【备考2023】高中生物新教材一轮复习学案
第37讲　基因工程
[素养目标]
1．运用结构与功能观，理解基因工程原理、技术和应用。(生命观念)
2．从基因工程诞生的历程中，体会科学发展的曲折性和必然性。(科学思维)
3．理清DNA的粗提取与鉴定的原理及操作流程。(科学探究)
　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。
(4)基础：生物化学、分子生物学和微生物学等学科。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①作用：将外源基因送入受体细胞中。
②种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。
③条件：
a．具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
b．能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c．具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
1．(选择性必修3 P70图3 1)重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(×)
2．(选择性必修3 P71正文)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
3．(选择性必修3 P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(×)
4．(选择性必修3 P72正文)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(×)
5．(选择性必修3 P72正文)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(×)
1．选择性必修3 P71“旁栏思考”：根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是____________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全
2．选择性必修3 P74“拓展应用1”：限制酶不切割细菌本身的DNA分子是因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开
3．选择性必修3 P72正文拓展：天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？
提示：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
1．基因工程的理论基础[科学思维]
2．与DNA有关的几种酶的比较[生命观念]
3．标记基因的作用[科学思维]
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
[探究意图：以限制酶的功能为情境信息考查理解能力]
如图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题：
(1)EcoRⅠ和HpaⅠ的识别序列和识别位点分别是什么？产生的末端分别是哪种类型？
提示：EcoRⅠ限制酶的识别序列是-GAATTC-，切割位点在G、A之间，切断磷酸二酯键，产生的是黏性末端，HpaⅠ限制酶的识别序列是-GTTAAC-，切割位点在T、A之间，切断磷酸二酯键，产生的是平末端。
(2)DNA连接酶有哪两种？来源有什么不同？作用有什么不同？
提示：DNA连接酶有两种，即E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。前者来源于大肠杆菌，后者是从T4噬菌体中分离出来的。E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，又能将双链DNA片段平末端之间进行连接，但连接平末端之间的效率比较低。
突破点1　
1．如图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个核苷酸
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点体现了酶具有专一性，A正确；据图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个核苷酸，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为—GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中核糖核苷酸序列，D错误。
答案：D
2．下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性内切核酸酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是________________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是________，和限制性内切核酸酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶________切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是________________________________________________________________________、
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制性内切核酸酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。
(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。
(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
答案：(1)磷酸二酯键　黏性末端和平末端　(2)DNA连接酶　无　(3)Ⅰ　Ⅱ　限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏　目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
突破点2　
3．(多选)某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(　　)
A．导入大肠杆菌的质粒不一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
解析：导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A正确；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。
答案：AD
4．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
并且________________和__________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因、有一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞
　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA半保留复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
2.基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)基因表达载体的构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
类型 方法 说明 特点
植物 细胞农杆 菌转化法 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物，但单子叶植物也获得了成功
花粉管通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物细胞 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物细胞 Ca2＋处理法 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 简便、经济、有效
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测目的 检测方法
分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 RCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交
个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验
1．(选择性必修3 P76正文)目的基因就是指编码蛋白质的基因。(×)
2．(选择性必修3 P77“相关信息”)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
3．(选择性必修3 P80正文)基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。(×)
4．(选择性必修3 P80正文和图3 6)基因表达载体中含有启动子和密码子。(×)
5．(选择性必修3 P82正文)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。(√)
6．(选择性必修3 P82正文)从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。(×)
1．选择性必修3 P77“相关信息”改编：Bt抗虫蛋白造成害虫死亡的原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡
2．选择性必修3 P77“相关信息”改编：PCR的引物是________________________
________________________________________________________________________。
用于PCR的引物长度通常为________个核苷酸。
提示：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　20～30
3．选择性必修3 P79“旁栏思考”：PCR可以扩增mRNA吗？
提示：不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
1．图解PCR的扩增过程[科学探究]
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)
2．基因表达载体的构建[生命观念]
(1)图解限制酶的选择原则
①不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
②保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
③确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
(3)根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
3．筛选出含有目的基因的受体细胞[科学思维]
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
[探究意图：以基因表达载体图示为情境信息考查理解能力]
分析基因表达载体模式图，回答下面问题。
(1)标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？
提示：标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常见的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因；四环素抗性基因。
(2)构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
提示：由图知，目的基因要插入启动子和终止子之间，这是因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。
(3)为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
突破点1　
1．农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
注：子链从引物的3′端开始延伸
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
解析：PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置，D正确。
答案：C
2．(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；Taq DNA聚合酶的作用是催化___________________________________________________________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′ ②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′ ③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′ ④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5 ′AACTATGCG－－－－－AGCCCTT 3′
B．5 ′AATTCCATG－－－－－CTGAATT 3′
C．5 ′GCAATGCGT－－－－－TCGGGAA 3′
D．5 ′TTGATACGC－－－－－CGAGTAC 3′
解析：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列来进行切割。(2)步骤Ⅱ中用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升温到95 ℃是为了解开DNA双链获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板延伸形成子链的过程。(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是②。(4)图中由片段F形成的环状DNA的未知序列中有一个EcoRⅠ限制酶的切割位点，而EcoRⅠ识别的位点是　因此片段F的单链中的一端应含有“AATTC－－－－－”序列，另一端应含有“TTAAG－－－－－”序列，只有B项符合题意。
答案：(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)PCR中的复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
(3)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
(4)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，利用蛋白质工程改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。
突破点2　
3．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是(　　)
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法
解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程。我国科学家独创的方法是花粉管通道法。
答案：D
4．(多选)菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述正确的是(　　)
A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B．将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上构建表达载体
C．可以将菊花叶片取下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞
D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：要获得转基因菊花，可以选择菊花叶片细胞作为受体细胞，但不能选择桃蚜细胞作为受体细胞，A错误；Ti质粒的T DNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上，B正确；可以将菊花叶片取下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株，C正确；已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，故应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度，D正确。
答案：BCD
　基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)基因工程在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；
⑥改善畜产品的品质。
(2)基因工程在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们生产药物。
②让哺乳动物批量生产药物。
③尝试将建立移植器官工厂的设想成为现实。
(3)在食品工业方面的应用：利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
2．蛋白质工程的原理和应用
(1)蛋白质工程的概念
(2)蛋白质工程的基本原理
(3)蛋白质工程的应用
①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
1．(选择性必修3 P88正文)来自苏云金杆菌的Bt毒蛋白基因只能应用于棉花。(×)
2．(选择性必修3 P88正文)“转基因抗虫植物”也可以用于抵抗各种植物疾病。(×)
3．(选择性必修3 P90“资料卡”)干扰素是我国批准生产的第一个基因工程药物。(√)
4．(选择性必修3 P91“相关信息”)用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(√)
5．(选择性必修3 P93黑体)对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的。(×)
1．选择性必修3 P91“正文”：利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以____________________________________，然后再结合________技术，培育出不会引起____________反应的转基因克隆猪器官。
提示：抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因　克隆　免疫排斥
2．选择性必修3 P94“思考·讨论”节选：确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
提示：确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别[科学思维]
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
2.蛋白质工程与基因工程的区别和联系[科学思维]
[探究意图：以培育抗虫棉为情境信息考查问题解决能力]
如图为通过基因工程培育抗虫棉的过程，请回答：
(1)图示的转化方法是哪一种？其有何特点？
提示：农杆菌转化法。将目的基因整合到受体细胞染色体上，可稳定遗传。
(2)抗虫棉能抗病毒、细菌和真菌吗？为什么？
提示：不能。抗虫基因具有专一性。
(3)经上述过程培育的抗虫棉能否取得最后的成功，最简单的检测方法是什么？
提示：做抗虫实验。
突破点1　
1．下列关于基因工程技术应用的叙述，错误的是(　　)
A．基因工程技术可定向改良农作物的某些品质
B．利用细菌代谢旺盛的特点生产基因工程药物
C．运用基因工程技术让牛合成并分泌人类抗体
D．噬菌体作为载体可以将重组DNA导入动物细胞获得转基因动物
解析：基因工程技术可定向改良农作物的某些品质，A正确；利用细菌代谢旺盛的特点将细菌利用基因工程手段改造成工程菌，生产基因工程药物，B正确；运用基因工程技术经所需抗体的相关基因导入牛的受精卵中，达到让牛合成并分泌人类抗体的目的，C正确；噬菌体是细菌病毒，不能作为载体将重组DNA导入动物细胞，D错误。
答案：D
2．科学家培养的转基因奶牛的乳腺细胞能够合成并分泌人凝血因子，这是动物乳腺生物反应器研究的重大进展。下列叙述正确的是(　　)
A．在该转基因牛中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
B．“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人凝血因子基因
C．人凝血因子基因开始转录后，DNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
D．转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子
解析：根据题意，在该转基因工程中，人凝血因子基因导入的受体细胞是牛的受精卵，由该受精卵发育形成的个体的各种体细胞中都存在人凝血因子基因，A错误；“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞合成更多的人凝血因子，B错误；人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA，C错误；转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子，D正确。
答案：D
3．(2020·山东卷)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了____________________，
从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为__________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录(或反转录)过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中Wx的mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
答案：(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录(或：反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
突破点2　
4．如图表示利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素(一种糖蛋白)的核心流程，下列叙述正确的是(　　)
A．该过程得到的干扰素与自然界中的干扰素相同
B．图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往是唯一的
C．蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
D．蛋白质工程是通过对蛋白质的结构进行修饰或合成来操作的
解析：图示是利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素，该过程得到的干扰素是经过改造的，与自然界中的干扰素不相同，A错误；由于密码子的简并性，图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往不是唯一的，B错误；结构决定功能，蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，C正确；蛋白质工程是通过对基因的结构进行修饰或合成来操作的，D错误。
答案：C
5．(多选)新冠病毒通过面刺突蛋白(S蛋白)的活性域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白的RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法合理的是(　　)
A．LCB1的结构可能与S蛋白的抗体有相似之处
B．S蛋白的RBD结构可以为设计LCB1提供信息
C．生产LCB1用到了基因工程的操作技术
D．可直接从细胞中获取基因用于LCB1的生产
解析：S蛋白的抗体能与S蛋白的RBD特异性结合，而根据题干可知，LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合，说明LCB1的结构可能与S蛋白的抗体类似，A正确；由于LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合，故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计，B正确；生产LCB1用到了蛋白质工程，其中一些步骤用到了基因工程的操作技术，例如人工合成DNA，C正确；由题意可知蛋白质LCB1是一种自然界中不存在的蛋白质，故不能从细胞中获取相应的基因，D错误。
答案：ABC
　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)实验步骤
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验原理
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)实验步骤
(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
1．选择性必修3 P74~75“探究·实践”：DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？
提示：不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2．选择性必修3 P84~85 “探究·实践”：DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？
提示：电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。
3．选择性必修3 P84~85 “探究·实践”：你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
提示：多条条带。不止一条条带的原因：操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或还有其他DNA片段，以此为模板，进行了扩增。
突破点1　
1．(2019·江苏卷)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析：哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A项错误。DNA析出过程中，搅拌要轻柔，以防止DNA断裂，B项正确。DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C项正确。向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D项正确。
答案：A
2．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法不正确的是(　　)
A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关
C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物
D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查
解析：PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；分子的大小、形态、凝胶的种类、密度，电泳的电压大小等都会影响分子迁移速率，B正确；在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物，C正确；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。
答案：A
突破点2　
3．在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述，不正确的是(　　)
A．该载体最可能为环状DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
答案：D
4．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g，剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下、另一组置于－20 ℃条件下，分别保存24 h。
DNA的粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA的鉴定：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验的课题名称是____________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少_________________________________
________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
解析：(1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为“探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量较多。(2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA断裂。(3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。(4)氯仿能使蛋白质变性沉淀，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。
答案：(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响　(2)DNA断裂　(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢　(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
[构建知识网络]
[强化生命观念]
1．限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
3．PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，2种引物，4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
4．基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
5．对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
真题再现　感悟考情
1．(2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)
A．①＋③　　　　　　　　 B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
解析：图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，即B正确，A、C、D错误。
答案：B
2．(2018·北京卷)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　)
A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误。
答案：D
3．(2020·浙江卷)下列关于基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
解析：基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，B项错误；抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该链状DNA上一定至少有2个被酶切开的位置。
答案：D
4．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4(T4)DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用T4(T4)DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________________
________________。
解析：(1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4(T4)DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键，将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体，质粒DNA分子上必须有复制原点，才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制；且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，可以将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中，能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，RNA聚合酶与该区域结合可驱动基因转录出mRNA。
答案：(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　限制酶切割位点　将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中，能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞　(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
5．(2021·山东卷)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________________________________________________________________________，
理由是__________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)观察含载体的部分结构的图示，荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切点，分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切点，但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割，切割后的载体图示如下：
扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段，并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的P片段连接起来。由于F1～F7中有XhoⅠ限制酶切割位点，所以需寻找能代替XhoⅠ限制酶，且切割后的产物能与XhoⅠ限制酶切割后的产物连接的限制酶，而SalⅠ就符合这一要求，所以在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；而调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点，所以需寻找能代替MunⅠ的限制酶，且切割后的产物能与MunⅠ限制酶切割后的产物连接，而EcoRⅠ就符合这一要求；所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如下图所示：
即用EcoRⅠ和SalⅠ切割调控序列及启动子，用MunⅠ和Xho Ⅰ切割载体。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明F1～F6与R扩增产物含完整的启动子，荧光蛋白基因表达；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，雌激素能诱导启动子发挥作用。构建的载体含有BCL11A基因，导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，说明F1～F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子，荧光蛋白基因不表达)，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，说明F5～F6与R扩增产物上均无结合位点(启动子完整，荧光蛋白基因能表达)，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上

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