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第38讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
[课程导学]
内容要求 5.1.基因工程是一种重组DNA技术。5．2.蛋白质工程是基因工程的延伸。6．1.转基因产品的安全性引发社会的广泛关注。6．2.中国禁止生殖性克隆人。6．3.世界范围内应全面禁止生物武器。
与旧教材对比 增：①DNA的粗提取与鉴定；②DNA片段的扩增及电泳鉴定；③基因工程在食品工业方面的应用。删：①基因文库的构建；②基因枪法；③基因治疗；④基因身份证的讨论。改：①PCR技术内容更充实；②DNA重组技术改为重组DNA技术；③关注生物技术的伦理问题改为关注生殖性克隆人。淡化：①从基因文库中获取目的基因精减为一句话；②农杆菌转化法变为资料卡。
考点一　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
　①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。
④在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
(3)载体
　与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(1)基因工程的原理是基因重组，不过这种变异是定向的。(　　)
(2)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(　　)
(3)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　)
(4)E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(　　)
(5)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(　　)
(6)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　　)
答案：(1)√　(2)×　(3)×　(4)×　(5)√　(6)×
1．(选择性必修3 P71旁栏思考)(1)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(2)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自身的DNA分子？_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：(1)切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害　(2)原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
2．(选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶________(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是________，而DNA聚合酶是把单个的________连接到已有的DNA片段上。②________起作用时需要以一条DNA链为模板，而________不需要模板。
提示：不是　两个DNA片段　脱氧核苷酸　DNA聚合酶　DNA连接酶
1．基因工程的理论基础
2．限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择Pst Ⅰ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择Sma Ⅰ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
(3)根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
3．标记基因的作用：可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
4．与DNA有关的几种酶的比较
突破1 基因工程工具酶的应用
核心素养 生命观念
1．用限制酶EcoR V单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoR V和Mbo Ⅰ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoR V限制酶切割后的一个黏性末端)。
若用Mbo Ⅰ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为(　　)
A．2.5和5.5　　　　　　　 B．2.5和6
C．5.5和8 D．6和8
答案：D
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neor表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(　　)
A．图甲中的质粒用BamH Ⅰ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒和外源DNA
C．用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，可以保证目的基因与质粒正确连接
D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：选C。图甲中的质粒只有一个BamH Ⅰ的切割位点，切割后形成一个直链DNA，含2个游离的磷酸基团，A错误；根据图乙可知，BamH Ⅰ的切割位点在目的基因上，故不能用该酶切割外源DNA，B错误；用PstⅠ和Hind Ⅲ酶切，可以保证目的基因与质粒正确连接，C正确；导入目的基因的大肠杆菌，其重组质粒是用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ切割形成的，其中的ampr(氨苄青霉素抗性基因)已被破坏，D错误。
突破2 基因工程载体的应用
核心素养 生命观念
3．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子等。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________________________________。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　(3)受体细胞
四类受体细胞的筛选与判定
当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：
上述四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出(1)(2)与(3)(4)，而通过PCR等技术，可进一步区分(3)与(4)。　
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因。
(2)获取方法——利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA的半保留复制。
②条件
a．场所：在缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
b．模板：DNA双链。
c．原料：4种脱氧核苷酸。
d．酶：耐高温的DNA聚合酶。
e．引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③过程
a．变性：当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链。
b．复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
c．延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
⑤鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
　a．在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
b．引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
c．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
　启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
①启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
②终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游，作用是使转录在所需要的地方停止。
③起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
　若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：①目的基因与目的基因的连接；②目的基因与质粒的连接；③质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
3．将目的基因导入受体细胞
(1)植物细胞
　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
(2)动物细胞：显微注射法，将目的基因注入动物的受精卵中。
(3)原核生物：先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
4．目的基因的检测与鉴定
　分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时，①都遵循碱基互补配对原则；②都使用基因探针，探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。
(1)所有的目的基因都可以从基因文库中获取。(　　)
(2)用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的酶是DNA连接酶。(　　)
(3)基因表达载体中含有启动子和密码子。(　　)
(4)Ti质粒上的T DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　)
(5)目的基因的检测和鉴定过程中，分子水平的检测方法都是PCR技术。(　　)
(6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　)
(7)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　　)
答案：(1)×　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×　(6)√
(7)×
1．(选择性必修3 P79旁栏思考题)PCR不可以扩增mRNA的原因是_____________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR
2．(选择性必修3 P81内文信息资料卡拓展)为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？__________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________
提示：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义
3．(选择性必修3 P83到社会中去)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？______________________________________
__________________________________。
提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
1．目的基因的筛选与获取(拓展)
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
(2)目的基因的获取方法
①利用PCR获取和扩增目的基因。
②人工合成目的基因
a．逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
b．化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
③从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
2．PCR技术的过程
(1)
(2)循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0 2 6 2n－2
共消耗的引物数量 2 6 14 2n＋1－2
注：第三轮循环后，开始出现双链等长的目的基因片段。
突破1 PCR技术
核心素养 科学思维
1．(2022·天津高三模拟)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，使目的DNA得以迅速扩增。其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术叙述错误的是(　　)
A．PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
B．PCR技术制备大量DNA时引物要被不断消耗
C．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因
解析：选C。DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，C错误。
2．(2020·高考江苏卷改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到超过90 ℃是为了获得________；耐高温的DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′—AACTATGCG…………AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG…………CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT…………TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC…………CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点，使切割后的DNA片段具有相同的黏性末端。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中，升温到超过90 ℃是为了使DNA变性，DNA双链解聚为DNA单链，以作为DNA扩增的模板链。耐高温的DNA聚合酶以单链DNA为模板，以结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将4种游离的脱氧核苷酸按5′→3′方向沿模板链顺序合成新的DNA子链，故其作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中，已知的DNA序列如下所示：
，
要通过设计引物进行反向PCR，从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(过程如反向PCR的原理示意图)，则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，因此要选择5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′和5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′这对引物。(4)分析题意可知，片段下的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT—，3′端序列为—TTAA，B正确。
答案：(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
突破2 基因工程的操作程序
核心素养 科学思维
3．(不定项)(2021·辽宁省适应性考试模考)菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述正确的是(　　)
A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B．将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上构建表达载体
C．菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：选BCD。科学家将目的基因导入了菊花细胞，故受体细胞可以选择菊花叶片细胞，但不能选择桃蚜细胞，A错误；基因工程中构建表达载体时，由于T DNA可以转移到受体细胞内， 故可以将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上，B正确；菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因的导入，C正确；已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长，故应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度，D正确。
4．人参是一种名贵中药材，具有良好的滋补作用。干扰素可用于治疗慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤。下图为三种限制酶识别序列与酶切位点及制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的示意图。请回答下列问题：
(1)图中①的DNA用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ完全酶切后，反应管中有________种DNA片段。以一个DNA为模板，利用PCR技术扩增干扰素基因时，扩增第n次时，需要________个引物，设计引物序列的主要依据是____________。
(2)假设图中质粒上BamH Ⅰ识别位点的碱基序列变为了另一种限制酶BclⅠ识别位点的碱基序列，现用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ切割质粒，那么该图中①的DNA右侧选择________进行切割，理由是________________________。
(3)在构建重组质粒的过程中，用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ切割质粒和目的基因比只用BamHⅠ好，这样可以防止________和__________。②过程需要用到的酶是__________。
(4)④过程检测人参愈伤组织细胞是否产生干扰素，所用的方法是______________________。
答案：(1)4　2n　干扰素基因两端的部分核苷酸序列　(2)BamH Ⅰ　BamHⅠ、Bcl Ⅰ切割后产生的黏性末端相同　(3)目的基因的自身环化　目的基因反向接入质粒　DNA连接酶　(4)抗原—抗体杂交
[事实概述类]
1．在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：侵染植物，将目的基因转移到受体细胞中
2．[2017·全国Ⅱ，T38(2)改编]以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成DNA
3．[2017·江苏，T33(4)改编]PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏__________的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的复性温度。
答案：引物与模板　G、C含量高
4．[2015·全国Ⅰ，T40(2)]从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：抗体　抗原、抗体特异性结合
5．质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：切割产生的DNA片段末端与EcoR Ⅰ切割产生的末端相同
6．为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用________进行检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：PCR技术　将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
[原因分析类]
7．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_____________________________________________
____________________________。
答案：未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
8．[2017·全国Ⅰ，T38(2)]若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是________________________________________________________________________。
答案：噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
9．[2017·全国Ⅱ，T38(3)]若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
答案：目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子
10．[2019·全国Ⅰ，T38(3)改编]目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________
________________________________________________________________________。
答案：耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
考点三　基因工程的应用与蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)基因工程在农牧业方面的应用
(2)基因工程在医药卫生领域的应用
　乳腺生物反应器与膀胱生物反应器
a．乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，二者的优点是产量高、质量好、成本低、易提取，且不必对动物造成伤害。
b．乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长时期的雌、雄动物均可生产。
②器官移植：在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官。
(3)基因工程在食品工业方面的应用
2．蛋白质工程
　基因工程不会导致受体细胞或生物产生“新基因”或“新蛋白质”。
(1)Bt基因来源于苏云金杆菌，对哺乳动物有毒害作用。(　　)
(2)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(　　)
(3)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(　　)
(4)为延长干扰素保存时间，需要替换氨基酸；为提高玉米中赖氨酸含量，需要在蛋白质中加入赖氨酸。(　　)
(5)由大肠杆菌工程菌获得的人干扰素可直接应用。(　　)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构。(　　)
答案：(1)×　(2)×　(3)√　(4)×　(5)×　(6)×
1．(选择性必修3 P90文字改编)利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是
________________________________________________________________________。
提示：药用蛋白基因没有转录或翻译
2．(选择性必修3 P94图3－17)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？________________________________________________________________________。
提示：通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。原因是任何蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功了，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传
突破1 基因工程的应用
核心素养 社会责任
1．(不定项)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是(　　)
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的大肠杆菌细胞可用Na＋处理
D．过程④可利用RCR技术检测目的基因是否已导入受体细胞
解析：选AD。过程①表示利用mRNA通过逆转录法合成目的基因，逆转录过程中需要逆转录酶的催化，A正确；过程②表示利用PCR技术对目的基因进行扩增，该过程中不需要利用解旋酶，解旋是通过高温实现的，B错误；大肠杆菌细胞应利用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误；过程④可利用RCR技术检测目的基因是否已导入受体细胞，D正确。
2．(2020·高考全国卷Ⅲ)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
回答下列问题：
(1)步骤①中需要使用的工具酶有______________________________________。步骤②和③所代表的操作分别是________和________。步骤④称为________。
(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的________________(答出2点即可)的限制。
(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________(填“相同”或“不同”)，原因是_____________________________________________________________________
__________________________________。
(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有______________________(答出2点即可)。
答案：(1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶　显微注射　体外培养　胚胎移植　(2)性别、年龄　(3)相同　两种上皮细胞都是体细胞且来源于同一个受精卵　(4)体外受精、胚胎移植
突破2 蛋白质工程及其应用
核心素养 生命观念、社会责任
3．新冠病毒的表面刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白的RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是(　　)
A．LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似
B．LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计
C．LCB1是通过细胞中原有基因表达产生的
D．可用蛋白质工程进行LCB1的设计
解析：选C。LCB1是自然界中不存在的蛋白质，故无法通过细胞中原有基因表达产生，C不合理。
4．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有改造________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即___________________________________________________________________
__________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期的蛋白质功能出发，通过____________________和______________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计预期的蛋白质结构　推测应有的氨基酸序列　功能
基因工程与蛋白质工程的比较
(1)区别
项目 基因工程 蛋白质工程
过程 筛选和获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
实质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品 定向改造或生产人类所需的蛋白质
结果 只能生产自然界已存在的蛋白质 可生产自然界没有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行改造。　
考点四　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)方法步骤(以洋葱为例)
　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作为材料。
③鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。待试管冷却后，结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)原理
①PCR原理：DNA的热变性原理，即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳
(2)方法步骤
①PCR扩增
②鉴定PCR产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
　a．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
b．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
c．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
d．观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(　　)
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(　　)
(3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。(　　)
(4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(　　)
(5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。(　　)
答案：(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×
1．(2022·北京高三模拟)下图是快速RT PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列叙述错误的是(　　)
A．逆转录酶具有DNA聚合酶能力
B．③PCR过程只需要引物b
C．RT PCR可检测基因表达水平
D．RT PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
解析：选B。③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的，B错误。
2．用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如下图所示。以下叙述不正确的是(　　)
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：选D。能被限制性内切核酸酶酶切的DNA片段仍为双链DNA，D错误。
3．(不定项)(2022·黄山模拟)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述正确的是(　　)
A．通过①操作使NaCl溶液浓度降至0.014 mol/L，析出DNA
B．经①②操作，DNA留在纱布上；经③②操作，则DNA留在滤液中
C．图④是用预冷的体积分数为95%的酒精来进一步纯化粗提取的DNA
D．图①③④都需要玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以防止破坏DNA
答案：BC
考点五　生物技术的安全性与伦理问题
1．转基因成果
2．关注生殖性克隆人
3．禁止生物武器
(1)对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域。(　　)
(2)转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期。(　　)
(3)高产青霉素菌株属于转基因成果。(　　)
(4)中国政府主张对治疗性克隆和生殖性克隆的有效监控并进行严格审查。(　　)
(5)设计试管婴儿与试管婴儿技术没有区别。(　　)
(6)生物武器可通过吸入、误食、接触带菌物品，被带菌昆虫叮咬等侵入人体。(　　)
答案：(1)√　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×　(6)√
突破1 转基因成果
核心素养 社会责任
1．(2022·山东临沂高三期末)现在转基因技术已经相当成熟，前不久美国批准转基因三文鱼进入市场，旨在利用生物技术提升水产产业，不过这种转基因三文鱼目前只能在加拿大和巴拿马饲养。下列关于转基因技术的叙述，正确的是(　　)
A．转基因技术的原理是DNA分子杂交
B．转基因技术的应用解决了人类史上的很多难题，是有利无害的
C．现在很多转基因食品包装都有警示标志
D．转基因食品比传统食品的营养更丰富，因此在不久之后转基因食品会替代传统食品
答案：C
2．(2022·安徽蚌埠一模)转基因食品存在“是否安全”的争议，有人认为转基因食品是有害的。比如抗“草甘膦(除草剂)”转基因农作物的种植，使喷洒除草剂的人患癌症。请用已学知识判断，以下说法正确的是(　　)
A．自古就有“吃啥补啥”的说法，所以吃了转基因食品，则其中的基因会整合到人的基因组中
B．严格管理好目的基因和控制好目的基因的表达部位，则转基因食品的安全性可以得到保障
C．若食用转基因大米，就一定会对人的健康造成危害
D．抗除草剂植物生产的食品会导致人患癌症
答案：B
突破2 关注生殖性克隆人、禁止生物武器
核心素养 社会责任
3．(2022·山东百师联盟联考)2018年11月，世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿诞生。这项研究用到了能够精确定位并修饰基因的基因编辑技术，即基因编辑时用约为头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的RNA引导序列注入受精卵中，对CCR 5基因进行修改，预期婴儿出生后能天然抵抗人类免疫缺陷病毒，关于该技术的安全性问题，下列说法错误的是(　　)
A．基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果
B．经过基因编辑的个体，有可能影响基因选择性表达，而导致其他疾病的产生
C．将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德
D．只要加强监管、完善法律法规、完善技术手段，不需担心基因编辑技术的安全性
解析：选D。可以加强监管、完善法律法规、完善技术手段，但基因编辑技术仍存在一定的安全性问题，D错误。
4.(2022·泰州高三模拟)“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出，在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育到如右图所示的时期，再将胚胎植入女性子宫内发育成胎儿，它使一部分不能生育的夫妇重新获得了生育的机会。下列叙述正确的是(　　)
A．“试管婴儿”技术在生物学上所依据的原理是无性生殖
B．如图所示时期是胚胎发育的囊胚期，1代表内细胞团，2代表囊胚腔，3代表滋养层
C．“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、体内培养、核移植
D．“试管婴儿”技术诞生后，继而出现了“设计试管婴儿技术”，二者对人类的作用是相同的
解析：选B。“试管婴儿”技术中存在体外受精，因此属于有性生殖，A错误；图示时期是胚胎发育的囊胚期，1代表内细胞团，2代表囊胚腔，3代表滋养层，B正确；“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、早期胚胎培养、胚胎移植，C错误；“设计试管婴儿”技术可用于治疗需要骨髓移植或造血干细胞移植的疾病，“试管婴儿”技术用于解决不孕不育问题，D错误。
“试管婴儿”和“设计试管婴儿”的比较
(1)图示过程中①②③是“试管婴儿”的培育过程，①②④⑤是“设计试管婴儿”的培育过程。
(2)后者比前者多了胚胎移植前的“遗传学诊断”或“基因诊断”。
(3)前者主要是解决不孕夫妇的生育问题，后者主要用于白血病、贫血症等的治疗。
(4)两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。　
[体验等级考]
1．(2021·高考河北卷改编)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
(1)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是______________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是______________________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是________________________________________。
(3)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(4)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________(写出两点即可)。
答案：(1)限制酶和DNA连接酶　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(2)农杆菌转化法　防止YCF1基因通过花粉传播，造成基因污染
(3)富集能力　叶
(4)转基因杨树可利用Cd转运蛋白将Cd搬运至液泡内，导致细胞液浓度增大　杨树是多年生植物，更有利于持续储存Cd，且杨树的根系更发达
2．(2021·高考辽宁卷改编)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入____________和____________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTTTTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ CAG↓CTGGTC↑GAC PstⅠ CTGC↓AGGA↑CGTC
KpnⅠ G↓GTACCCCATG↑G BamHⅠ G↓GATCCCCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于________的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________(填“G1”“S”或“G2/M”)期。
解析：(2)根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。由图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态，以提高转化效率。(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRⅠ和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因的两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应电泳图是菌落3。(5)图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞未能完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
答案：(1)逆转录　(2)EcoRⅠ　PvitⅡ　T4DNA连接酶　(3)感受态　(4)3　(5)G2/M
3．(2021·高考海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是___________________________________________________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是________________。
(3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________________。随后，Cas9蛋白可切割________________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是____________。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：____________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)DNA连接酶　(2)感受态细胞法　(3)碱基互补配对原则　目标DNA特定的核苷酸　(4)DNA分子杂交技术　出现杂交带　(5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入基因组DNA中
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