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新高考生物一轮考点梳理&分层训练
第31讲　微生物的培养技术及应用
内容比较——知考向 核心素养——提考能
内容要求 1.阐明无菌技术在微生物培养中的应用 2.概述微生物分离和纯化的常用方法 3.概述测定微生物数量的常用方法 4.活动：通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌菌落 5.活动：分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数 科学思维 分析培养基的成分及其作用，比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同；掌握无菌技术及微生物的纯培养
科学探究 设计实验探究微生物培养的条件，利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中微生物的计数问题
社会责任 关注有害微生物的控制及宣传健康生活等
与旧教 材对比 改：①大肠杆菌纯化培养改为酵母菌的纯培养；②分解纤维素微生物的分离改为课后习题呈现。 删：①菌种的保藏；②制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤。
考点一　微生物的培养技术及应用
1.培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)培养基的种类、特点及用途分析
(3)培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析
提醒　(1)是否含有凝固剂(如琼脂)是区分半固体培养基和液体培养基的唯一标准，含凝固剂的为半固体培养基。
(2)常见选择培养基举例
①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
(3)自养型微生物与异养型微生物的区别
①划分自养型微生物与异养型微生物的主要依据是能否以CO2作为碳源。需根据微生物的代谢特点去选择相应的培养基。如自养型微生物可以利用空气中的CO2，缺碳培养基可以培养自养型微生物。
②自养型微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养型微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中的营养物质判断微生物的代谢类型。含氮无机物不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质提供能量，如NH3既为硝化细菌提供氮源，也作为能源物质。
2.无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
3.微生物的纯培养
(1)微生物纯培养的操作步骤
培养物、纯培养物、纯培养
　(2)倒平板的操作步骤
倒平板操作的注意事项
①培养基要冷却到50__℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
⑤在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
⑥整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(3)平板划线法操作步骤
平板划线操作的注意事项
①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。
②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区域不要与第一区域相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(√)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(×)
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(√)
(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(×)
(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(√)
(6)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(×)
(7)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(√)
1.为什么培养基需要氮源？
选择性必修3 P10“旁栏思考题”
提示　微生物细胞内有蛋白质、核酸、脂肪等多种含氮的营养物质或代谢产物，培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质及代谢产物的原料。
2.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
选择性必修3 P10“旁栏思考题”
提示　无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
3.平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
提示　最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连，则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
1.常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象
(2)灭菌方法及适用对象
2.几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH、NO等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
3.平板划线操作中几次灼烧接种环的目的
项目 第一次划线前灼烧 每次划线前灼烧 最后一次划线结束灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
考向1　结合无菌技术，考查实验设计及方案实施能力
1.(2020·江苏卷，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案　B
解析　倒平板后无需间歇晃动，A错误；图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。
2.(2021·山西高三适应考试)自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：
(1)对培养基进行灭菌时，多采取________法，而对接种环或涂布器灭菌时则用________法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧________次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的________开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中________培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了_____________________。
(3)甲、乙两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据(统计时间内微生物总数小于环境容纳量)，得到如表结果：
培养时间/小时 24 48 72 96
甲组菌落均值/个 18 25 36 32
乙组菌落均值/个 20 28 38 32
据表可知，计数时最好取培养________小时记录的菌落数作为实验结果，一方面是由于培养时间较短，会遗漏菌落数目，另一方面是由于____________________________________。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　灼烧灭菌　6　末端　相连　(2)倒置　作为对照组，排除培养基被杂菌污染的可能　(3)72　培养时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落
解析　(1)对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环或涂布器灭菌时则用灼烧灭菌法。接种环在每次接种前都要灼烧灭菌，最后一次接种完也要灭菌，所以在固体培养基表面连续进行了5次划线，需要对接种环灼烧6次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的末端开始划线，使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终获得由单个菌体形成的单个菌落。最后一次划的线不能与第一次划的线相连。(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温培养箱中倒置培养，以减少培养基中水分的挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组，排除培养基被杂菌污染的可能。(3)根据表中数据可知，甲组和乙组中的菌落数都在72小时达到最大，由此推知最好取72小时记录的菌落数作为实验结果，原因：①培养时间不足会遗落菌落数目；②培养时间过长会导致两个或多个菌落连成一个菌落，使计数不准确。
考向2　结合微生物的纯培养，考查科学思维能力
3.(2019·全国卷Ⅲ，37)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________________________________________________。
硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是____________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
答案　(1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌
解析　(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以利用空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
考点二　微生物的选择培养和计数
1.微生物筛选的原理
(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。即根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)筛选方法
方法 特点 举例
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源的培养基可筛选自生固氮微生物
利用某种化学物质进行的选择培养 在培养基中加入某种化学物质，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素的培养基可抑制细菌，分离出真菌
利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物
2.稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养
(1)系列稀释操作
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板操作
(3)稀释涂布平板法计数的几个注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
③计数时机：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
④用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。 这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
(2)实验流程
(3)统计细菌数目的方法
①显微镜直接计数法
即稀释涂布平板法
②间接计数法——活菌计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(4)实验结果分析与评价
4.分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(×)
(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(√)
(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(×)
(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(×)
1.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
2.选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
考向1　结合选择培养基成分及配制方法，考查科学探究能力
1.(2020·浙江7月选考，19)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是(　　)
A.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C.酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D.适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
答案　A
解析　利用尿素固体培养基筛选尿素分解菌时，尿素固体培养基并不直接杀死其他微生物，而是其他微生物不能以尿素为氮源，无法在尿素固体培养基中存活，A错误；不同的微生物生长所需的最适pH不同，如细菌适宜生活在中性偏碱环境，霉菌适宜生活在中性偏酸环境，因此配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；利用糯米酿酒需要先进行糖化，酵母菌不能直接利用淀粉进行发酵，C正确；醋化醋杆菌的发酵底物可为一定浓度的酒—水混合物，适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化，D正确。
2.(2020·全国卷Ⅰ，37)[生物——选修1：生物技术实践]
某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是________________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：________________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
解析　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
考向2　围绕土壤中分解尿素细菌的分离，考查科学探究能力
3.(2020·山东聊城期初)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。下列关于土壤中分解尿素细菌的分离和计数的叙述，正确的是(　　)
A.分解尿素的细菌是以尿素的分解产物CO2作为碳源的
B.倒平板时应将打开的培养皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C.培养基中KH2PO4等的作用之一是作为缓冲剂保持pH稳定
D.若实验组菌落平均数为37个/平板，空白对照平板上有3个菌落，则本组菌落数的平均值为34个/平板
答案　C
解析　分解尿素的细菌是异养型，不能以CO2作为碳源，A错误；倒平板时，不能将打开的培养皿盖放到一边，以免被杂菌污染，B错误；无机盐可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH的稳定，所以培养基中KH2PO4等的作用之一是作为缓冲剂保持pH稳定，C正确；在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落，若空白对照组出现菌落，说明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用，D错误。
4.(2017·全国卷Ⅰ，37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是____________________________
________________________________________________________________________，
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是___________________________
________________________________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
答案　(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH的稳定
解析　(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，既可维持培养基pH的相对稳定，又能为微生物生长提供无机盐离子。
重温真题　经典再现
1.(2019·北京卷，3)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种 菌落直径：C/mm 透明圈直径：H/mm H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
有关本实验的叙述，错误的是(　　)
A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B.筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
答案　C
解析　微生物培养基含有四类营养物质：水、无机盐、碳源、氮源，A正确；常用稀释涂布平板法筛选淀粉分解菌，涂布前需将菌液稀释，B正确；淀粉分解菌可分解淀粉，导致菌落周围的淀粉被分解，不能与碘液反应生成蓝色，故而出现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明细菌分解淀粉能力越强，D正确；由题图可知，细菌Ⅰ和Ⅱ形成的菌落周围都出现了透明圈，说明两种细菌都能将淀粉酶分泌至细胞外，C错误。
2.(2020·山东卷，20)野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是(　　)
A.操作过程中出现杂菌污染
B.M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C.混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D.混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
答案　B
解析　若操作过程中出现杂菌污染，则基本培养基上会有杂菌生长，从而出现菌落，A正确；若M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸，则M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后会出现许多由单个细菌形成的菌落，但由于M、N菌株的遗传物质没有改变，将这些菌落分别接种到基本培养基上时，培养后不会再有菌落出现，B错误；若混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质或菌株中已突变的基因再次发生突变，都会造成遗传物质改变，则混合培养一段时间，充分稀释涂布到基本培养基上培养后会有菌落出现，将这些菌落再分别接种到基本培养基上培养后，也会有菌落出现，C、D正确。
3.(2019·江苏卷，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C.接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
答案　A
解析　培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，对人造成危害，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数可以使用固体培养基，D正确。
4.(2019·全国卷Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________________________。
(2)若将土壤悬液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是_____________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________________和___________________________。
答案　(1)牛肉膏、蛋白胨　X
(2)下降　不能降解X的细菌因缺乏碳源而不能增殖，能降解X的细菌能够增殖
(3)稀释涂布平板法
(4)能量　合成其他物质的原料
解析　(1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，相当于是选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，不能降解X的细菌因缺乏碳源而不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
课后·分层训练
(时间：35分钟)
1.(2021·重庆质量抽测调研)不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养物质的描述，不正确的是(　　)
A.氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B.碳源物质也为该微生物提供能量
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
答案　B
解析　培养基中的氮源物质可以为该微生物提供必要的氮素，A正确；以CO2为唯一碳源的自养微生物，CO2不能为其提供能量，B错误；无机盐可以为微生物提供碳、氮以外的重要元素，是该微生物不可缺少的营养物质，C正确：水是生物体新陈代谢不可缺少的物质，是该微生物的营养要素之一，D正确。
2.(2021·太原实验中学调研)微生物的实验室培养要进行严格灭菌和消毒。下列关于灭菌和消毒的叙述，正确的是(　　)
A.灭菌和消毒均可以杀死环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子
B.无菌操作时，对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行灭菌
C.灼烧法灭菌的对象是金属器具，不可以是玻璃器具
D.消毒和灭菌的原理是相同的
答案　D
解析　灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死物体表面或内部的部分微生物，不能杀死芽孢和孢子，A错误；无菌操作时，对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行消毒，B错误；灼烧法灭菌的对象可以是金属器具和玻璃器具，C错误；消毒和灭菌的原理相同，都是使微生物的核酸或蛋白质变性，D正确。
3.(2020·上海鲁迅中学联考)下图表示小方同学在实验室培养大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法错误的是(　　)
A.①②③步骤需要在酒精灯火焰旁操作
B.培养基中必须含碳源、氮源、无机盐和水
C.③步骤接种环多方向划线是为了便于细菌计数
D.接种结束后，将④倒置放入培养箱中培养
答案　C
解析　①②③步骤依次表示倒平板、用接种环蘸取菌液、进行平板划线，为了防止被杂菌污染，操作时都需要在酒精灯火焰旁进行，A正确；不同的微生物对营养物质的需求存在差异，但水、碳源、氮源和无机盐是各种异养型微生物所需的基本营养物质，大肠杆菌是异养型微生物，所以其培养基中必须含碳源、氮源、无机盐和水，B正确；③步骤为平板划线法接种大肠杆菌，不能用于计数，C错误；划线接种结束后，将④平板倒置后放入培养箱培养，防止冷凝水污染培养基，同时避免培养基中水分过快地挥发，D正确。
4.(2021·山东济宁检测)下列有关微生物培养的叙述，正确的是(　　)
A.配制固体培养基时，所加的琼脂是从红藻中提取的脂类
B.划线操作时，不能将最后一次的划线与第一次的划线相连
C.分离计数时，可用平板划线法对需计数的微生物进行分离
D.纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内的摇床上培养
答案　B
解析　配制固体培养基时，所加的琼脂是从红藻中提取的多糖，A错误；划线时要避免最后一次的划线与第一次的划线相连，因为最后一次的划线菌种是最少的，而第一次的划线菌种是最致密的，如果连在一起可能影响单个菌落的分离效果，B正确；平板划线法只能用于分离单个菌落，不能用于计数，C错误；摇床应在液体培养基培养微生物时使用，培养皿中的是固体培养基，D错误。
5.(2021·山东日照联考)“筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是(　　)
A.在牛肉膏蛋白胨培养基中，筛选大肠杆菌
B.在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物
C.用纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物
D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体植物
答案　A
解析　在牛肉膏蛋白胨培养基中，几乎所有细菌都能生长，不能筛选大肠杆菌，A符合题意；在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，只有能分解尿素的微生物才能生长，B不符合题意；以纤维素为唯一碳源的培养基，只有能分解纤维素的微生物才能生长，C不符合题意；在培养基中加入不同浓度的氯化钠，能够筛选出抗盐突变体植物，D不符合题意。
6.(2021·河北冀州中学联考)下列关于细菌分离、培养的叙述中，正确的是(　　)
A.不同种类细菌的生长均需要相同碳源
B.常用液体培养基分离获得细菌单菌落
C.用含尿素的培养基可选择分离出能分解利用尿素的细菌
D.含有机磷农药的培养基可分离出降解有机磷农药的细菌
答案　D
解析　不同种类细菌的生长需要的碳源一般不同，A错误；常用固体或半固体培养基分离获得细菌单菌落，B错误；用只含尿素作为氮源的培养基可选择分离出能分解尿素的细菌，C错误；含有机磷农药的培养基可分离出降解有机磷农药的细菌，D正确。
7.(2021·河北承德一中联考)某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品悬液。下列相关叙述错误的是(　　)
A.图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为唯一碳源
B.如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C.若图中④为对照实验，则其中应含除苯酚外的其他碳源
D.⑥上菌落分布均匀，是用平板划线法获得的单菌落
答案　D
解析　要筛选获得只能降解利用苯酚的细菌菌株，图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为唯一碳源，A正确；如果要测定②中活细菌的数量，常采用稀释涂布平板法，B正确；④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入苯酚作为碳源，C正确；⑥上菌落分布均匀，是用稀释涂布平板法获得的单菌落，D错误。
8.(2020·济南外国语学校联考)某种菌在30 ℃的环境下，经过6周后会产生2种不同的酶，几乎可将PET塑料完全分解。下图是分离、纯化和保存菌株的过程，相关叙述正确的是(　　)
A.塑料垃圾中含有大量微生物，是分离该菌株的首选样品
B.筛选培养基中需要加入PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落
C.通过涂布平板法可以获得单菌落
D.斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株
答案　B
解析　塑料垃圾中含有大量微生物，但不一定含有分解PET塑料的菌株，A错误；筛选培养基中需要加PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落，从而获得分解PET塑料的菌株，B正确；在涂布平板上长出的菌落，可以通过划线或稀释涂布平板法进一步纯化得到单个菌落，C错误；斜面培养基中含有大量营养物质，可在低温下临时保存菌株，如果长期保存菌种应选择甘油管藏法，D错误。
9.(2019·全国卷Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是
________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即
________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________________________。
答案　(1)W
(2)乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
(4)①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近
解析　(1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)图示信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
10.(2021·云南昆明三中测试)某些菌可将尿素分解成CO2和NH3。欲从土壤中分离能分解尿素的细菌，某研究小组利用成分为KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、琼脂、尿素的培养基进行了相关实验。请回答：
(1)在土壤微生物的培养过程中，培养基中的KH2PO4与Na2HPO4除了可以作为________被细菌利用外，它们还具有的功能为________________________。
(2)该培养基对土壤中的微生物具有选择作用，理由是_________________________________。微生物能分解尿素的原因是其能合成________。
(3)为获得目的菌的单菌落，常对土壤样液做________处理。为便于确认目的菌，可在培养基中加入________指示剂，接种并培养菌种后，可根据菌落周围________判断出该菌能分解尿素。
答案　(1)无机盐　维持培养基的pH相对稳定　(2)尿素为该培养基中的唯一氮源，只有能以尿素为氮源的微生物才能在此培养基上生长、增殖　脲酶　(3)稀释　酚红　出现红色
解析　(1)培养基中的KH2PO4与Na2HPO4除可作为无机盐被细菌利用外，还可构成缓冲液，维持培养基的pH相对稳定，利于微生物的生长与增殖。(2)该培养基中的尿素为唯一氮源，只有能以尿素为氮源的微生物才能在此培养基上生长、增殖，所以该培养基对土壤中的微生物具有选择作用。微生物能分解尿素的原因是其能合成脲酶，脲酶可将尿素分解为氨。(3)为获得目的菌的单一菌落，常用无菌水对土壤样液做稀释处理。尿素分解菌合成的脲酶可将尿素分解成氨，氨可使培养基的pH升高，进而使酚红指示剂变红，所以为便于确认目的菌，可在培养基中加入酚红指示剂，接种并培养菌种后，可根据菌落周围出现红色判断出该菌能分解尿素。
11.(2021·江苏无锡期末)土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收和利用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。如图1表示制备固体培养基过程中的某操作，图2是科研人员从土壤中分离出菌株Q的部分过程示意图。
请回答下列问题：
(1)图1所示操作称为________，待平板冷凝后需________，以防止________________________________________________________________________。
(2)图2所示接种方法是__________________。在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为________个。
(3)图3是某同学利用不同于图2的方法分离菌株Q的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的有________。
图3
a.操作前用无水乙醇对双手进行消毒处理
b.划线时将沾有菌种的接种环插入培养基
c.只有在⑤区域中才能得到所需菌落
d.整个过程需要对接种环进行6次灼烧
(4)固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈(图4)，透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)代表微生物溶解难溶性磷酸盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。
图4
菌株 透明圈直径(D) 菌落直径(d)
M－3－01 18.8 12.3
B3－5－6 20.7 8.0
T－4－01 9.1 6.5
根据实验结果分析溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是________。
答案　(1)倒平板　倒置　皿盖上的冷凝水落入培养基　(2)稀释涂布平板法　4×107　(3)a、b、c　(4)B3－5－6
解析　(1)图1所示操作称为倒平板，待平板冷凝后倒置，以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。(2)图2所示接种方法是稀释涂布平板法。称取1 g土壤，按如图所示方法溶解和稀释后，在三个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别是38、42、40，据此可计算出每克土样中的活菌数为×103×100÷0.1 ＝4.0×107。(3)图3是平板划线的接种操作。操作前应用70%的乙醇溶液对接种人员的双手进行消毒处理，a错误；划线操作时将菌种涂抹在培养基表面，b错误；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养都可获得所需菌落，c错误；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，整个过程需要对接种环进行6次灼烧，d正确。故选a、b、c。(4)根据实验原理中“透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)代表微生物溶解难溶性磷酸盐的能力大小”，结合表格中数据可以确定解磷能力最强的菌株是B3－5—6。

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