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基因工程和植物克隆知识点总结
专题一基因工程:
1、基因工程的概念:基因工程是狭义的遗传工程:指按照人们的愿望，将某种生物的目的基因，通过体外DNA重组和转基因技术，移到另一种生物的细胞中，并使基因所携带的遗传信息在受体细胞中表达，创造出更符合人们需要的新的生物类型用生物产品的技术。
(1)基因工程操作水平是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做重组DNA技术。
(2)基因工程技术的变异原理:基因重组
基本原理是让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达；可以定向改变生物的性状， 培养人们需要的生物品种。
★(3)基因工程的核心:构建重组DNA分子
2、基因工程诞生的理论基础: DNA是生物遗传物质的发现、DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。
3、基因工程创建的技术保障:限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现与应用。
4、基因分离和重组的必要手段是:限制性核酸内切酶、DNA连接酶
★5、不同DNA分子可以连接的原因是不同生物的DNA分子都是双螺旋结构。受体细胞中目的基因可以表达的原因是不同生物共用一套遗传密码子。
6、 基因工程的基本工具——限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和载体(或运载体)
★基因工程的基本上工具酶——限制性核酸内切酶和DNA连接酶， 注意一定不能答载体
(1)“分子手术刀” ——限制性核酸内切酶
①来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
⑧结果:将DNA分子切割成片段，顶端具有粘性末端或平末端（回文结构特点)
④注意:不切割细菌自身细胞内的DNA序列(没有相应序列)，不切割单链RNA序列。
(2)”分子“缝合针”——DNA连接酶
①作用:将具有末端碱基互补的2个DNA片段连按在一起，即将外源基因和载体DNA连接在一起，称为重组DNA分子，作用的化学键是缝合磷酸二酯键。
②与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
(3)“分子运输车”——载体
1.载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因， 供重组DNA的鉴定和选择。
④大小合适，具有一定的安全性，对宿主细胞无伤害。
2.最常用的载体是质粒，它是一种能够自主复制的双链环状DNA分子，是一种遗传物质，独立于拟核(或细胞核)之外，裸露(即不与蛋白质结合)。
③其它载体: λ 噬菌体、动植物病毒，质粒和噬菌体主要载入大肠杆菌等，动植物病毒载入动物或植
物细胞内。
④在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
★注意:标记基因通常用抗生素抗性基因或荧光蛋白质基因
7、基因工程的基本操作程序:获得目的基因，形成重组DNA分子(核心关键) ;将重组DNA导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞，目的基因的表达。
第一步:获得目的基因—— 一般需要限制性核酸内切酶在目的基因两侧切取
★获取目的基因的方法: (1) 如果目的基因序列已知可以用化学方法合成目的基因或用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因;
(2)如果目的基因序列未知可以建立一个包括目的基因在内的基因文库，从基因文库中获取(此方法不一定需要限制性核酸内切酶)。
第二步:形成重组DNA分子: (1) 目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)需要的工具:通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA(如质粒)，可以形成相同的粘性末端。再用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。
注意:限制性核酸内切酶的选择是常考点:原则是不损坏目的基因和标记基因(至少保留一个) ，为了防止任意连接，尽量用两种限制酶分别切割目的基因和载体DNA。
(3)重组DNA分子组成:至少有目的基因+启动子+终止子+标记基因，有时还考虑复制原点。
①启动子又称为启动部位:是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，属于基因的一部分，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。
化学合成方法，如逆转录法合成的基因没有启动子和终止子结构，需要在载体中加入。
②终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，转录停止的信号。
③标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有重组DNA分子，主要是含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
第三步:将重组DNA导入受体细胞
(1)转化的概念:将目的基因与载体连接后，导入特定的受体细胞内的过程(并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程)。目的基因在宿主细胞内可以随重组载体复制出大量的目的基因。
(2)常用的导入(或转化)方法:
①将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法(主要适用于双子叶植物和裸子植物)，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
②将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是:先用Ca2+ (氯化钙)处理细胞， 增加大肠杆菌细胞壁的通透性使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子和感受态细胞溶于缓冲液中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA分子、完成转化过程
第四步:筛选含有目的基因的受体细胞:原因:有的细胞没有接纳重组DNA分子(一般较多)。重组DNA导入受体细胞后，筛选含有重组DNA分子的受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第五步:目的基因的检测和表达
(1)首先检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
基因探针:是指用放射性同位素或荧光分子等标记的已知DNA分子单链。
(2)其次检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质(一般作为抗原)，
用相应的抗体进行抗原—抗体杂交(此方法用蛋白质的特定空间结构结合，不是碱基互补配对)。
(4)有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状，进行抗虫接种实验。
8、基因工程的应用
(1) .转基因植物——植物基因工程:抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
①抗虫棉，抗盐碱地的农作物，耐寒的番茄，抗除草剂的玉米，富含赖氨酸的转基因玉米，改变花卉的花色等。 ②优点: 与传统育种相比，培育新品种所需时间较短，克服了远缘亲本难以杂交的障碍。
农杆菌转化法:利用农杆菌中的Ti质粒中的T-DNA分子可以整合到宿主细胞的染色体DNA上的特性，将目的基因插入Ti质粒中的T-DNA分子中间—>农杆菌( 氯化钙处理)—>侵染植物细胞-→T-DNA携带目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上。
(2).转基因动物一动物基因工程: 提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
①如导入人的生长激素基因的鲤鱼，比一般的鲤鱼长的快且大。
②用转基因动物生产药物:乳腺生物反应器(乳房生物反应器)
③转基因动物作器官移植的供体:最大的难题是解决免疫排斥问题
如:利用基因工程技术，使哺乳动物本身变成“批量生产药物的工厂”
大概过程:目的基因(蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子)→显微注射法导入哺乳动物受精卵 —>培养成早期胚胎—>移植到母体子宫内孕育—>分娩出产生药品蛋白质转基因动物(一 定是雌性动物)
(3)基因工程药物蛋白质类药品制剂
①胰岛素:是一种蛋白质类激素，存在于人和动物的胰脏中。方法一般是:从人的胰岛β细胞中提取mRNA—>逆转录产生单链DNA—>双链DNA—>与载体结合—>重组DNA分子—>氯化钙处理大肠杆菌—>筛选含有目的基因的大肠杆菌生产胰岛素原(没有生物活性)—>人工加工得到成熟的胰岛素。
②干扰素:是病毒侵入细胞后产生的糖蛋白，它有α、β和γ三大类型。具有抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。a-干扰素是我国第一个基因重组新药。
③乙型肝炎疫苗:用乙型肝炎病毒的抗原基因作为目的基因，导入酵母菌或哺乳动物细胞进行生产抗原。
(4)基因治疗:是向目标细胞(有基因缺陷的细胞)中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷(注意没有替换掉有缺陷的基因)。正常功能基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗病症的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
基因治疗包括:体外基因治疗(多数)和体内基因治疗。
补充:基因诊断:是指用基因探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测样本上的遗传信息，从而达到检测病症的目的，如镰刀形贫血症，苯丙酮尿症，癌症等。
(5)基因工程与生态环境保护
工程菌:用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系一般称为工程菌。
①利用转基因植物生产聚羟基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。
②改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力。如超级细菌
③利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。
解决方案选择:其原则是可行性和简便性。
(6)蛋白质工程:利用基因工程技术对天然蛋白质进行改造，以便获得具有理想生物学功能的蛋自质(自然界没有的蛋白质种类)。
★专颗二 克隆技术
1、无性繁殖的优点:保持亲本的遗传性状;一次产生后代的数量很大，可以迅速扩大其种群的数量。
2、克隆即无性繁殖指只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代分子、细胞或个体。
克隆技术是指从众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得且的基因或特定类型细胞的操作技术。
3、基因克隆和细胞克隆是现代生物技术中的关键技术，在基础科研、遗传育种和肿瘤生物治疗等方面广泛应用。
4、将重组DNA分子导入特定的宿主细胞的导入过程叫转化。在被转化的宿生细胞中可以随着重组载体复制出大量的目的基因。
5、胚胎细胞克隆不属于严格意义上的动物个体克隆。
6、克隆的基本条件:细胞具有的发育全能性是生物克隆的基本条件。具体描述为以下3条
(1)具有含物种完整基因组细胞核的活细胞(如乳腺上皮细胞)。
(2)能有效调控细胞核发育的细胞质物质(如去核的卵细胞质)。(3)完成胚胎发育的必要环境条件(如诱导核—质重组细胞生长分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境)。
7、植物克隆技术的基础是植物组织培养。理论基础(原理) :植物细胞具有全能性
8、植物细胞的全能性
(1)由于不同种植物，不同基因型的同种植物个体间遗传性的差异，细胞全能性表达程度不同。拟南芥、烟草和番茄等容易再生新植株，而小麦、玉米和水稻等作物在多次继代培养后，会丧失细胞全能性表达能力。
(2)全能性最强的细胞是受精卵。
(3)长期培养中培养植物胚胎发生和器官形成能力下降，可能是因为
①遗传物质改变，如染色体畸变、细胞核变异或非整倍体的产生等。
②是细胞或组织中的激素平衡平衡被打破，或细胞对外源生长物质的敏感性下降。
③是因为产生了缺乏成胚性的细胞系。
(4)在生物的生长发有过程中，细胞并不会表现出全能性，原因是基因在特定的时间和空间条件下进行选择性表达，使得细胞进行分化形成不同的组织或器官。
9、植物组织培养技术
(1)程序:配置含有适当营养物质和植物生长调节剂的含0. 7% —1%琼脂的培养基—>切取小组织块 (外植体)—>获得愈伤组织—>生出新植株；
归纳为两个生理过程:脱分化(避光)和再分化(需光照每天14.5小时，叶绿素合成需要光照)
★(2)成功的条件:离体培养；无菌操作(培养和多种操作工具进行高压蒸汽灭菌法灭菌，外植体消毒)；适当的营养物质；植物生长调节剂(或植物激素) ;适宜的环境条件(如光照和温度)。
(3)愈伤组织:未分化，细胞排列疏松而无规则，高度液泡化(即液泡小，数量多)，呈无定形状态的薄壁细胞团。形成愈伤组织是需要创伤的刺激和植物激素的调节。
★愈伤组织经液体悬浮培养可分散得到单个细胞，这些细胞具有细胞质丰富，细胞核大,液泡体积小的胚性细胞的特点。需要放在摇床上进行震荡，作用是增加液体溶氧量，使细胞体系分布均匀，有利于物质传递。愈伤组织再分化的产物:
①给子适宜条件，有的植物可以直接发育成根、芽、花(如风信子)器官等，即器官培养。雄性花器官的培养成果显著，如子房的培养、胚囊的培养均已经取得进展。
②给予适当的培养条件，经过培养基中成分的诱导，可分化出芽和根的分生组织，再发育成完整植株。
★③愈伤组织分散为单个的胚性细胞，再依次到细胞团—>球形胚—>心形胚—>胚状体， 再发育成完整植株。
实现植物器官发生和形态建成，主要通过平衡植物激素配比进行，也有营养物质的配比。
(4)地位：是植物克隆的技术基础。
10、原生质体——细胞内有代谢活性的原生质部分，包括质膜、细胞质和细胞核。”
1制备方法:在0.5-0.6mol/L 的甘露醇溶液环境(维持较高渗透压，防止原生质体吸水胀破)下，
用纤维素酶和果胶酶(即酶解法)混合液处理离体的根尖，叶片、愈伤组织成悬浮培养细胞等，消化除去细胞壁，获得球形的原生质体。
(2)原生质体的应用:①进行植物体细胞杂交技术:即用两种不同种植物原生质体进行诱导(方法:电刺激或聚乙二醇诱导)融合—>杂种细胞(或重组细胞)—>培养生出新细胞壁(成功标志)→培养成愈伤组织—>胚状体—>新植株。
②转基因植物: 借助基因工程方法，将外源遗传物质 (DNA)导入受体细胞(包括原生质体受体)中，或通过细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。——植物细胞工程技术
③实例:使抗虫害、抗干旱、抗盐碱、抗低温和优质高产作物新品种的培育进入厂新高潮。原生质体的培养结合基因工程操作，也为许多遗传学，植物生理学和细胞生物学问题提供了良好的研究系统。
11、多途径的植物克隆实践
(1)、转基因植株:将外源遗传物质(DNA) 导入宿主细胞，培育出抗逆、高产及优质的转基因植株。
(2)植物细胞培养的其他多种研究和应用广泛开展:例如

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