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第2节　微生物的培养技术及应用
学习目标：
1.了解培养基的概念。并知道如何配制培养基。
2.阐明无菌技术是在操作过程中.保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.概述平板划线法和稀释涂布平板法。
4.通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌落。
学习内容：
一、培养基的配制
1．培养基的概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其生长繁殖的 。
2．作用：用以 、 、 、保存微生物或积累其 。
3．培养基种类
标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理性质 培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
培养基 不加凝固剂 常用于工业生产
功能 培养基 根据某种微生物的特殊营养要求配制 选择分离
培养基 加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂 鉴定
来源 培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
培养基 用已知的化学物质配制 分类鉴定
(1)固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂， (“能”、“不能”)为微生物生长提供能量和碳源。
(2)病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前 (“能”、“不能”)利用人工培养基来培养。
4．培养基的营养组成
(1)主要营养物质：水、 (提供碳元素的物质)、 (提供氮元素的物质)和无机盐。
(2)某种常见的细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5 g 、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10 g 和维生素等
NaCl 5 g 无机盐
H2O 定容至1 000 mL 水
(3)还需满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如：
①在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②在培养霉菌时，一般需要将培养基pH调至 性；
③在培养细菌时，一般需要将培养基pH调至 性或 性；
④在培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
二、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术主要包括 和 。
2．消毒
(1)概念：指使用较为 的物理、化学或 等方法杀死物体表面或内部 微生物。
(2)适用对象：操作的 、操作者的 和手等。
(3)常用方法：煮沸消毒、巴氏消毒等。
项目 主要方法 应用范围
消 毒 消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
消毒 30 W紫外灯照射30 min(损伤细菌的DNA) 接种室、接种箱或超净工作台
化学药剂 消毒 用体积分数为70%～75%的 、碘酒 皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿
3．灭菌
(1)概念：指使用 的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括 和
。
(2)适用对象：用于微生物培养的 、 用具和 等。
(3)常用方法：湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。
项目 主要方法 应用范围
灭菌 灭菌 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，试管口或瓶口等
灭菌 干热灭菌箱中，160～170 ℃的热空气中维持2～3 h 耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等
高压蒸汽灭菌( 灭菌) 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基等
4. 消毒和灭菌的比较
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为 的物理、化学因素
消灭微生物的数量 物体表面或内部 微生物 物体内外的 微生物
能否消灭芽孢、孢子 消灭 芽孢 能消灭 芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作者的衣着和手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
常用方法 消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 、 、
5.无菌技术可用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。
三、微生物的纯培养
(一)相关概念：
(1)将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为 。
(2)由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为 。
(3)获得纯培养物的过程就是 。
(二)纯培养步骤：微生物的纯培养包括 、 、 、 等。
(三)探究·实践——酵母菌的纯培养
1.实验原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是 。
2. 实验方法：采用 法和 法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
3. 实验步骤
(1)制备培养基：① ；② ；③ 。
Ⅰ.如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之 进行操作。
Ⅱ.倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过 灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
Ⅲ.倒平板时应待培养基冷却至 ℃左右时，在 附近倒平板。
Ⅳ.平板冷却凝固后，要将平板 。既可以防止水分过快蒸发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(2)接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
(
②在火焰旁冷却接种环。棉塞
放在操作台上。
) (
③将试管口通过
。
) (
①将接种环放在
上灼烧
)
(
④在
附近用接种环蘸取一环菌液。
) (
⑤将试管口通过
，并塞上棉塞。
)
(
⑦第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意
将最后一次的划线与第一次的划线相连。
) (
⑥在
附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
)
Ⅰ．每次灼烧接种环的时间和目的
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使 ，直至得到单个细胞
接种结束后 杀死接种环上 ，避免细菌污染环境和感染操作者
Ⅱ．在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的 端开始划线的原因是：划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要 ，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步 ，最终能得到由 个细胞繁殖而来的菌落。
Ⅲ．最后一次划线与第一次的划线 相连。因为最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则 了细菌的数目，得不到纯化的效果。
(3)培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个 的平板 ，放入 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
4．实验结果的分析
(1)培养未接种的培养基的目的是检测 (或检查 )。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基 ，应该重新制备；若无菌落生长，则说明 。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上 ，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到 的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
5．平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)接种前将接种环放在 。
(2)划线操作在 旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过 。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条 ，用接种环在培养基表面 划线，划线后 。
答案
一、1．营养物质 营养基质
2．培养 分离 鉴定 代谢物
3． 固体 半固体 液体 选择 鉴别 天然 合成(1)不能 (2)不能
4．(1)碳源 氮源 (2) 碳源 氮源 (3)①维生素 ②酸性 ③中 弱碱 ④无氧
二、1.消毒 灭菌
2．(1)温和 生物 一部分(2)空间 衣着(3) 巴氏 煮沸 紫外线
3．(1)强烈 所有 芽孢 孢子(2) 器皿、接种 培养基 (3) 灼烧 干热 湿热
4. 温和 强烈 一部分 所有 部分 全部 煮沸 灼烧灭菌 干热灭菌 湿热灭菌
三、(一)(1)培养物 (2)纯培养物 (3)纯培养 (二)配制培养基 灭菌 接种 分离和培养
(三) 1.菌落2.平板划线 稀释涂布平板
3. (1)①配制培养基 ②灭菌 ③倒平板Ⅰ.前 Ⅱ.火焰 Ⅲ. 50 酒精灯火焰Ⅳ.倒置
(2)连续划线 稀释分散 ①火焰 ②不能 ③火焰 ④火焰 ⑤火焰 ⑥火焰 ⑦不要
Ⅰ．杀死接种环上原有微生物 末 每次划线时菌种数目逐渐减少 残留的菌种
Ⅱ．末 少 减少 单 Ⅲ．不能 增加了细菌的数目 (3)未接种 倒置 28
4．(1)培养基是否被杂菌污染 培养基制备是否合格 被污染 未被污染 (2)相似
(3)不同形态
5．(1)酒精灯火焰上灼烧 (2)酒精灯火焰 (3)火焰 (4)缝隙 迅速 及时盖上皿盖

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