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第2节　基因工程的基本操作程序
学习目标:
1.简述PCR的原理、条件及过程。
2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
3.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。
4.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。
学习内容：
一、目的基因的筛选与获取
1.筛选合适的目的基因
(1)目的基因的概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
等的基因。
(2)主要类型：主要是 的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
(3)选方法：从相关的 的基因中进行筛选。
2.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理： 。
(2)PCR反应的条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的
4种脱氧核苷酸 合成DNA 的原料
(体外用高温代替) 打开DNA双链
(耐高温的) 催化合成DNA子链
引物(长度通常为20～30个核苷酸) 分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
温度 控制温度使 在体外反复进行
缓冲液(含Mg2＋) 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活
(3)PCR扩增的过程
①变性：当温度超过 ℃时，目的基因DNA受热变性后解聚为 。
②复性：当温度下降到 ℃左右时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到 ℃左右时，以 为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核苷酸加到 的3’端。
3.用PCR方法扩增目的基因时 知道基因的全部序列。
4.PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越 。
5.PCR的每一个循环都包括 → → 三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。
二、基因表达载体的构建
1.操作目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够
作用。
2.基因表达载体的组成及其作用
一个基因表达载体的组成，除了 、 外，还必须有 、
等(如图所示)。
3.基因表达载体的构建过程
(1)用一定的 切割载体，使其出现一个有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 种或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入适量 ，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞
①花粉管通道法
方法一：用微量注射器将含 的DNA溶液直接注入 中。
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 进入胚囊。
②农杆菌转化法
a．原理：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染 植物和裸子植物，而对大多数 植物没有侵染能力
b．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有 质粒，侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 。
c．方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与 共培养→筛选转化细胞→再生成植株
方法二：将花序直接浸没在含有 的溶液中→培养植物并获得种子→筛选、鉴定
2.导入动物细胞：利用 将目的基因注入动物的 中
3.导入原核细胞：通常选用 作为受体细胞，用 处理大肠杆菌细胞→将重组的 导入其中。
四、目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)导入水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测受体细胞的 上是否插入了 。
(2)转录水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测目的基因是否转录出了 。
(3)翻译水平
①技术手段： 技术。
②检测目的：检测目的基因是否 。
2.个体水平的鉴定
(1)鉴定方法：例如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
(2)鉴定目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的 及程度。
课堂练习：
1.以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(　　)
A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
2.科学家构建了含有大洋鳕鱼抗冻蛋白基因启动子和大鳞鲑鱼生长激素基因的表达载体，并将其导入了大西洋鲑的细胞中，获得了生长速度加快的转基因大西洋鲑。相关叙述正确的是(　　)
A.转基因大西洋鲑体内抗冻蛋白明显增加
B.构建基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
C.大鳞鲑鱼生长激素基因不能通过PCR技术扩增获得
D.转基因大西洋鲑生长激素含量增加导致生长速度加快
3.下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(　　)
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法
D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
4.下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析下列叙述正确的是(　　)
A.过程①需要DNA连接酶
B.过程②需要限制酶
C.目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D.若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和Ⅰ的碱基序列相同
答案
一、1.(1)表达产物
(2)编码蛋白质
(3)知结构和功能清晰
2. (1) DNA半保留复制
(2) 模板 子链 解旋酶 DNA聚合酶 3′ DNA复制 Mg2＋
(3)①90 单链 ②50 两种引物 ③72 单链DNA 引物
3.不必
4.高
5.变性→复性→延伸
二、1.表达和发挥
2.目的基因 标记基因 启动子 终止子
启动子 上游 RNA聚合酶 终止子 下游 转录 标记
3.(1) 限制酶 (2) 同 产生相同末端
(3) DNA连接酶
限制酶 相同 DNA连接酶
三、1.①目的基因 子房 DNA 花粉管通道
②a．双子叶 单子叶b． Ti T DNA 染色体DNA上c．农杆菌 农杆菌
2.显微注射 受精卵
3.大肠杆菌 Ca2＋ 基因表达载体
四、1. (1)①PCR ②染色体DNA 目的基因
(2)①PCR ② mRNA
(3)①抗原—抗体杂交 ②翻译出特定的蛋白质
2.(2)遗传特性
课堂练习：
1.答案　B
解析　基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；基因表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。
2.答案　D
解析　转基因大西洋鲑体内生长激素明显增加，A错误；构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误；大鳞鲑鱼生长激素基因能通过PCR技术扩增获得，C错误；转基因大西洋鲑生长激素含量增加导致生长速度加快，D正确。
3.答案　D
解析　目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使大肠杆菌处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C正确；农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。
4.答案　C
解析　过程①发生碱基互补配对，不需要DNA连接酶，A错误；过程②发生碱基互补配对，不需要限制酶，B错误；用人工的方法化学合成目的基因必须知道目的基因的碱基序列，C正确；某质粒能与目的基因重组，只需要有相同的黏性末端即可，不必所有序列都相同，D错误。

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