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人教(2019)生物高考知识点梳理&对点训练
14.2　基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术
基因工程操作中目的基因的获取和基因表达载体的构建都离不开限制性内切核酸酶，只有选取合适的限制酶才能准确切取目的基因，因此限制酶的选取是基因工程操作的重点也是难点，近年来较难的高考试题大都围绕限制酶的选取进行考查。PCR技术既可以用于获取目的基因，又可以用于目的基因的检测与鉴定，是基因工程中重要技术之一，其应用较强，因此对PCR技术的考查也成为命题的热点。
1．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指___________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coli DNA连接酶连接，又可以用T4 DNA连接酶连接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体。质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目的基因的导入；质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
2．(2021·山东高考)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_____________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于______________________________________________，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子P的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ 和 XhoⅠ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ与限制酶EcoRⅠ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ 和XhoⅠ 切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物选用添加限制酶EcoR Ⅰ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ、限制酶Xho Ⅰ、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达　(3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
3．(2020·江苏高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种______________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__________；Taq DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
项目 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′ AACTATGCG……AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG……CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT……TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC……CGAGTAC 3′
解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为④和②。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
答案：(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
[知识梳理]
知能集成(一)　探讨基因工程操作中限制酶的选择方法
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[典例]　(2022·衡水模拟)玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白转基因玉米，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图所示。
请回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 ________________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 ____________________酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。T DNA在该实验中的作用是 ________________________________________________________________________
____________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入______进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，使植物的光合作用和 ________受到干扰，从而引起植物细胞死亡。
(3)愈伤组织是一种相对没有分化的 ________团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成 __________，再继续发育成转基因玉米株系。
[解析]　(1)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，能驱动基因的转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，则需要强启动子，因此应优先选用BamHⅠ和SacⅠ酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。农杆菌中Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此T DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上。(2)由图可知，标记基因是G418抗性基因，因此将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入G418进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，其中叶绿体是光合作用的场所，线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代谢)受到干扰，从而引起植物细胞死亡。(3)愈伤组织是一种相对没有分化的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成胚状体，再继续发育成转基因玉米株系。
[答案]　(1)RNA聚合酶　BamHⅠ和SacⅠ　将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上　(2)G418　呼吸作用(能量代谢)　(3)薄壁细胞　胚状体
[针对训练]
1．(2022·东城区二模)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI 121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作与实验目的不符的是(　 )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA ACA融合基因
B．与只用KpnⅠ相比，Kpn Ⅰ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
解析：选C　由图可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA ACA融合基因，A正确；图中质粒与GNA ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，B正确；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，D正确。
2．(2022·宁德模拟)将小菜蛾细胞的羧酸酯酶基因(CarE)导入水稻细胞，培育抗农药水稻新品种，过程如图所示。下列叙述错误的是(　 )
A．必须将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵
B．构建重组质粒时，应选用PstⅠ和SmaⅠ分别切割质粒和含CarE基因的DNA
C．Tetr的作用是鉴别和筛选含CarE基因的细胞
D．通过检测表达产物来判断CarE基因在水稻细胞中是否发挥功能作用
解析：选A　不一定要将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵，但是导入受精卵效果要好，A错误；Tetr是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确。
知能集成(二)　PCR技术中引物的相关问题分析
1．PCR技术和DNA复制的比较
项目 PCR技术 DNA复制
场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内(主要是细胞核内)
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
温度条件 在较高温度下进行需控制温度 细胞内温和条件
合成对象 DNA片段 DNA分子
相同点 均需要模板(DNA双链)、原料(四种脱氧核苷酸)、能量
2.与引物相关的问题归纳概括
(1)PCR技术需要引物的原因。
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(2)PCR扩增中需要引物数目的计算规律。
若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n＋1－2，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
[典例]　(2022·天津二模)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图1、2。分析回答：
(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入________________________________________________________________________等。
(2)在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：
引物A 5′ CCCCAACCGGAAAGTGTCA 3′(下划线字母为突变碱基)
引物B 5′ TAAGCTTCGAACATCCTA 3′(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)
引物C 5′ GTGAGCTCGCTGCCCCAA 3′(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)
则PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和图中大引物的________(填“①”或“②”)链。
(3)PCR的反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s,30个循环。在循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性；循环中72 ℃处理的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)据图2分析代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为________________________提供了可能。
(5)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，请你设计完成获得SCID模型鼠的实验步骤：
①杂交亲本：______________，杂交得F1；
②F1雌雄鼠随机交配得F2；
③提取F2每只小鼠的基因组DNA，采用分子生物学方法，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，则____________________________________________________为模型鼠。
[解析]　(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。(2)在PCR1中，获取的是大引物，大引物中含有突变基因，所以应含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C；而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有HindⅢ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。(3)在PCR循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性，使DNA双链解开；循环中72 ℃处理的目的是使Taq酶从引物起始通过碱基互补配对进行互补链合成。(4)代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为胚胎在受体内存活提供了可能。(5)①研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，若要获得SCID模型鼠，可让F0与野生鼠杂交得F1；②F1雌雄鼠随机交配得F2；③模型鼠中应含有突变基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因组DNA，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，若IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带的则为模型鼠。
[答案]　(1)Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸　(2)引物A和引物B　引物C　②　(3)使Taq酶从引物起始进行互补链合成　(4)胚胎在受体内存活　(5)①F0×野生鼠　③IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带
[针对训练]
1．据研究，新冠病毒表面的S蛋白是其主要的病毒抗原，在康复病人的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。如图为某机构研制新冠病毒疫苗的部分过程。下列叙述错误的是(　 )
A．对发热病人进行核酸检测可使用带标记的S基因做探针
B．使用PCR选择性扩增的前提条件是掌握S基因的核苷酸序列
C．过程②通常是将S基因和质粒连接以构建重组表达载体
D．S基因与培养的动物细胞核DNA整合是其稳定遗传的关键
解析：选B　对发热病人进行核酸检测时以S基因单链作为探针，若出现杂交链则细胞内有病毒存在，A正确；使用PCR选择性扩增的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，便于根据这一序列合成引物，不需要掌握S基因的全部序列，B错误；过程②是基因表达载体的构建，通常是将S基因和质粒用相同的限制酶处理后连接以构建重组表达载体，C正确；S基因整合到细胞核DNA分子中后能使S基因在细胞内稳定存在，是其稳定遗传的关键，D正确。
2．(2022·连云港期末)中国科学家陈薇院士团队研制的重组新冠疫苗制备流程如图1所示。回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是____________________，被用作载体的Ad5应具有的特点有____________________________________________等。
(2)对疫情重点地区输入的人员进行核酸检测需要用到用含放射性同位素的__________ 做探针，进行血清抗体检测的方法是________________杂交。
(3)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需要给不同组志愿者分别注射____________的疫苗，一段时间后采集血样检测相应抗体的水平。
(4)新型冠状病毒的检测最常见的方法是荧光定量RT PCR(逆转录聚合酶链式反应)，RT PCR 的具体过程如图2所示。
①过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是________________________________________________________________________。
②RT PCR过程通过对________的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。
③过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环扩增，理论上需要引物B为____________个。
解析：(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；作为基因工程的载体需要具备的条件有：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害等。(2)探针是指放射性同位素或荧光分子标记的目的基因；进行血清抗体检测的方法是抗原—抗体杂交。(3)探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果时，自变量是疫苗的剂量，因此需要给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样检测相应抗体的水平。(4)①Ⅰ为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化；Ⅱ为PCR技术扩增过程，该过程需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。②RT PCR过程通过对温度的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。③过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，由于起点是单链DNA，经过依次循环形成一个双链DNA分子，每个双链DNA分子都需要一个引物B，因此经过n次循环形成2n－1个子代DNA分子，也需要2n－1个引物B。
答案：(1)基因表达载体的构建　有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害　(2)目的基因　抗原—抗体　(3)不同剂量　(4)①逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶　②温度　③2n－1
[课时验收评价]
1．为增强玉米抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，获得抗旱的转基因玉米。下列相关叙述不正确的是(　 )
A．提取该微生物mRNA逆转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因
B．将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可以获得转化的农杆菌
C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格进行无菌操作
D．用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状
解析：选D　用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D错误。
2．(2022·抚顺二模)如图是三种限制酶的脱氧核苷酸识别序列和切割位点示意图(↓表示切点)。下列相关分析错误的是(　 )
A．这三种限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端
B．不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同
C．能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割
D．同一个DNA经限制酶1和限制酶3分别切割后所得片段数一定相等
解析：选D　能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割，但能被限制酶1切割的DNA不一定能被限制酶3切割，故同一个DNA经限制酶1和限制酶3分别切割后所得片段数不一定相等，C正确，D错误。
3．(2022·济南模拟)现有重组质粒甲(共含2 686个碱基对，不含T DNA)和乙(共13 400个碱基对)，为避免基因反接，研究人员用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割重组质粒甲、乙，再利用所得片段构建了重组质粒丙(如图所示)，然后采用农杆菌转化法将丙导入胡萝卜愈伤组织细胞。培养后得到转VP1基因胡萝卜植株。将重组质粒甲、乙和丙进行分组，每组只含其中一种重组质粒，同时用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，哪一组是切割重组质粒丙的结果(　 )
A．只得到含有2 146和540个碱基对的2种DNA片段
B．只得到含有540和12 400个碱基对的2种DNA片段
C．只得到含有12 400和1 000个碱基对的2种DNA片段
D．只得到含有540和13 400个碱基对的2种DNA片段
解析：选B　由题意知，重组质粒甲含有2 686个碱基对，若只得到含有2 146和540个碱基对的2种DNA片段，则是切割重组质粒甲的结果，A错误；由A项分析可知，限制酶Ⅰ切割可产生540个碱基对，那另外的12 400个碱基对片段，则是同时用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，B正确；重组质粒乙共13 400个碱基对，若只得到含有12 400和1 000个碱基对的2种DNA片段，则是切割重组质粒乙的结果，C错误；若得到含有13 400个碱基对的DNA片段，说明重组质粒乙未被限制酶识别并切割，D错误。
4．(2022·泰安模拟)限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等。下列对限制酶的选择，正确的是(　 )
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
解析：选D　用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒和目的基因。
5．植株在干旱、低温等逆境中，脱水素(具有一定抗干旱胁迫和耐冷冻能力的蛋白质)被诱导表达，脱水素基因编码区共含678个碱基对。科学家利用如图所示PBⅠ121质粒，以及XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，运用农杆菌转化法，将脱水素基因导入草莓试管苗叶片细胞，再经植物组织培养获得脱水素基因过量表达的转基因草莓植株。下列相关叙述错误的是(　 )
A．重组质粒利用SacⅠ和HindⅢ切割后能得到1 500 bp片段，则表明目的基因正确插入质粒
B．组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素和新霉素以便筛选转基因植株
C．可以利用PCR技术鉴定目的基因是否整合到草莓染色体的DNA上
D．转基因草莓植株批量生产前需进行抗干旱、耐冷冻实验
解析：选B　根据分析可知，由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了脱水素基因的678个碱基对，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500 bp的新片段，据此可确定目的基因正确插入了质粒，A正确；题中提供的限制酶切割位点对卡那霉素抗性基因没有影响，所以无论是否插入了目的基因，卡那霉素抗性基因都可以表达，起不到筛选转基因植株的作用，B错误；PCR技术是进行DNA扩增的技术，需要一段引物来进行扩增，依照脱水素基因的核苷酸序列设计一段引物，若能进行扩增，说明转入目的基因成功，C正确；植株批量生产前，需要在个体水平上进行抗干旱、耐冷冻实验，以确保转基因植物中的脱水素基因表达出了蛋白质并发挥了作用，使植物表现为抗干旱、耐冷冻，D正确。
6．研究表明，服用α 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoRⅠ识别，BamHⅠ识别。下列说法错误的是(　 )
A．步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列
B．在过程③中T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上
C．科研人员在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，目的是方便后续的剪切和连接
D．过程④中，科研人员最终未能检测出干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞
解析：选B　步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列，A正确；过程③是将重组质粒导入根瘤农杆菌，而在侵染人参愈伤组织细胞时，T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便后续的剪切和连接，C正确；干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录，均会导致不能检测出干扰素基因，D正确。
7．吡咯啉 5 羧酸合成酶(P5CS)是植物体合成脯氨酸的一种关键酶，脯氨酸是植物体内最有效的一种渗透压调节物质，具有很强的水溶性，其含量增加可使植物忍耐和抵御干旱的逆境。我国山东地区分布有大量盐碱地，为了获得更加耐旱的大豆，科研人员按照如图过程进行培育。
(1)通过PCR技术扩增P5CS基因，首先需要根据 __________________________________设计引物，设计的引物为何是成对的？________________________________________。PCR扩增过程中冷却至50 ℃左右的目的是 ________________________。
(2)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，并将目的基因插入Ti质粒中。利用Ti质粒、通过农杆菌转化法可将P5CS基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)将幼胚诱导成愈伤组织的过程为 __________，该过程所用的培养基中能发挥诱导作用的成分是____________________________________。
(4)若现已成功获得导入P5CS基因的大豆，请分析转基因大豆更加耐旱的原因是 ________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)设计引物要根据已知目的基因的核苷酸序列进行设计。DNA由两条链构成，PCR扩增时基因的两条链都要作为模板，且两条链的碱基排列顺序不同，故需要加入成对的引物分别与两条模板链结合。PCR扩增过程中冷却至50 ℃左右时引物可与模板链结合，为接下来子链的延伸做准备。(2)农杆菌转化法中，目的基因要插入到Ti质粒的T DNA上，该序列可转移，这样农杆菌感染植物细胞后，其中Ti质粒上的T DNA即可携带目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。(3)通过脱分化，可将已分化的幼胚诱导成愈伤组织，这与培养基中含有的生长素与细胞分裂素的含量和比例有关。(4)由题意可知，P5CS是植物体合成脯氨酸过程的一种关键酶，因此转基因大豆中脯氨酸的合成量增加，细胞质浓度增大，渗透压更高，更加耐旱。
答案：(1)已知目的基因的核苷酸序列　基因由两条链构成，其两条链都要作为模板合成子链　使引物与模板链结合　(2)Ti质粒上的T DNA具有可转移的特性，而农杆菌在自然条件下可感染双子叶植物。这样农杆菌中Ti质粒上的T DNA即可转移至受体细胞，并携带目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上　(3)脱分化　植物激素(生长素和细胞分裂素)　(4)与普通大豆相比，转基因大豆可合成P5CS，细胞内的脯氨酸含量更高，细胞质的渗透压更大

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