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PCR引物试题分析
高中生物学选择性必修三基因工程中，PCR技术是考查的重点难点内容之一，试题种类多，难度大。
1、目标片段的 DNA 分子经 PCR 反应循环n次，共需要消耗引物的数量为 个。
分析：PCR 反应的原理是利用DNA双链复制原理，PCR反应循环n次就是DNA分子扩增（复制）n次，产生DNA分子片段为2n个，单链为2n+1，其中每条子链的合成均需要1个引物，而2条母链不需消耗引物，故共需要消耗引物的数量为2n+1-2个。
参考答案：2n+1-2。
2、运用PCR技术扩增DNA分子时，需经过变性→复性→延伸→重复过程，经过4轮循环后，得到的子代 DNA 分子中，不同时含有两种引物的 DNA 分子占 。
分析：经过 4 轮循环扩增后，得到的子代 DNA 分子数目为2
4（或16）个，由于PCR过程中每条子链的合成均需要1个引物，且每一轮产生的子链均可成为下一轮的模板，所以不含引物的链为母链，始终2条，并且分布在2个DNA分子中，其余DNA分子均由两条方
向相反（含有两种引物）子链组成，故不同时含有两种引物的DNA分子占1/8。
参考答案：1/8。
例3、利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板 DNA、dNTP（包含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物以外，还应含有 Taq 酶。引物应选用图1中的 （填图中标号）。
分析：引物是利用PCR技术扩增目的基因的前提，合成的依据是目的基因两端的核苷酸序列，PCR过程中两个引物分别与目的基因两端结合，延伸方向相反，结果扩增出两个引物间的DNA片段。
参考答案：AD。
例4、为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中 。
分析：PCR鉴定目的基因的原理就是利用引物的特异性，添加特异性引物后看能否扩增出目的基因产物，故选引物甲和引物丙。
参考答案：引物甲、引物丙
例5、为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图3所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是 。
某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
分析：如果利用一个扩增目的基因的引物和一个扩增质粒的引物，这两个引物位于重组质粒两侧且方向相反，就能扩增出正确插入的目的基因，如果插入方向相反，则没有产物，故选择乙丙。据图 3，若扩增出的 DNA 片段为 400 bp，则正好是选择甲、乙作为引物后目的基因反向连接的结果，故原因是目的基因的反向连接。
参考答案：乙丙 目的基因的反向连接
例 6、为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的
端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
分析：在 PCR 技术中，引物的 3′末端必须与目的片段完全相配，引物的 5′末端可以不与目的片段互补。在耐高温的DNA聚合酶的作用下，从引物的3′端延伸DNA链，故限制性酶切位点相关序列应加在引物的5′端。
参考答案：5′。
例7、定点突变技术是指通过聚合酶链式反应（PCR）向目的基因片段中引入所需变化。GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第 65 至 67 位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第66位酪氨酸换成组氨酸，即可发出更明亮的蓝光，成为蓝色荧光蛋白（图4）。
定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，据图中信息人工合成短 DNA 引物应包含的序列是 。
分析：定点突变一般设计在引物的中间位置，突变位点碱基不能与模板链互补配对，但两侧序列可以互补配对，在Taq酶的作用下完成PCR扩增。由于第一轮产生的子链可以成为下一轮的模板，所以可以扩增出含定点突变的 DNA 片段。据题意可知，使第 66位酪氨酸换成组氨酸，只要将其对应DNA模板链中的ATG 变成 GTG 即可实现，故人工合成短 DNA 引物应包含的序列是AGAGTGCTC。
参考答案：AGAGTGCTC。
例8、如图 5 是科研人员利用重组 PCR 技术将A基因和B基因连接在一起的过程，先分别对两个基因进行扩增，除去多余引物后，将产物混合，再对产物进行 PCR 扩增，得到融合基因。 本实验 PCR1 和 PCR2选择的引物分别是 和 ，图中引物2或引物3设计的要求是 。
分析：PCR技术能扩增出方向相反的两个引物间的片段，据图可知PCR1应选择引物1和引物2，PCR2应选择引物3和引物4。图中显示PCR1和PCR2得到的产物可以通过碱基互补配对形成重叠区段，由此可知引物 2 和引物 3 是具有互补末端的引物，同时既能与基因 A 末端配对又能与基因 B 末端配对，故引物 2或引物3设计的要求是将两个基因的末端序列设计在同一引物中。
参考答案：引物 1 引物 2 引物 3 引物 4
将两个基因的未端序列设计在同一引物中

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