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6.基因工程类大题突破
1.(2022山东枣庄模拟)三氯生是一种抑菌物质,具有优异的贮存稳定性,可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。已知fabV(从霍乱弧菌中发现的烯酯酰ACP还原酶)基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生。
图1
图2
(1)通过PCR方法获取fabV基因时,Taq酶只能从　　　　　　　　延伸DNA链,而不能从头开始合成DNA,因此需要先根据　　　　　　　　　　　　　　　　　　设计两种特异性引物序列。反应体系的初始温度设置在90~95 ℃的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)在步骤④中,需将大肠杆菌菌液利用　　　　　　　　　　法接种到加有　　　　　　　　的细菌培养基上,待菌落长成后,直接挑取菌落加入PCR反应系统中进行基因鉴定。PCR过程中不需要先提取细菌DNA的原因是:　　　　　　　　　　　　　　。
(3)某科研团队将可以受温度调控的基因插入上述选出的重组质粒中,构建了温度调控表达质粒(如图2)。其中C基因在低温下会抑制P1,R基因在高温下会抑制P2。如果将lacZ基因和GFP基因插入图2质粒中,使其最后表现为低温下只表达GFP蛋白,而高温下只表达lacZ蛋白。则lacZ基因应插在　　　　　　　　之间,GFP基因插在　　　　　　　　之间。
2.(2022海南琼海三模)2020年中国政府提出“努力争取2060年前实现碳中和”的目标。发展利用生物能源是实现碳中和的有效途径。紫苏种子含大量油脂,出油率达35%~64%,三酰甘油(TAG)是紫苏种子的主要储藏脂类,DGAT1是TAG合成的关键酶。科研人员将紫苏DGAT1基因导入微藻中,培养高产生物柴油的工程藻,如图所示。
注:BamHⅠ和HindⅢ是两种限制酶。
回答下列问题。
(1)从紫苏组织细胞中提取总RNA时,需要加入RNA酶抑制剂,目的是　　　　　　　　。将RNA逆转录合成的cDNA作为模板,PCR扩增DGAT1基因,反应体系中需加入　　　　　　　　　　　　　　　　　　酶,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为使DGAT1基因两端分别添加BamHⅠ和HindⅢ识别序列,可将相应序列分别添加在两种引物的　　　(填“5'”或“3'”)端。
(2)构建DGAT1基因表达载体的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,使DGAT1基因能够表达并发挥作用。若只考虑DNA片段的两两连接,构建表达载体时可得到　　　种大小不同的连接产物。利用　　　　　　　　　　　　　　法将不同大小的DNA片段和连接产物分离,再将基因表达载体分离纯化,导入微藻细胞。
(3)若鉴定微藻基因组中整合有DGAT1基因,　　　　(填“能”或“不能”)说明高产油工程藻已生产成功。理由是:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。“碳中和”的含义是通过计算CO2的排放总量,然后通过植树等方式把这些排放量吸收掉。与使用石油等化石燃料相比,生产使用生物柴油有利于实现碳中和,原因是:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.(2022河北石家庄三模)研究发现人溶菌酶(hLZ)是天然抗生素替代品。科学家培育出转入溶菌酶基因的山羊,可大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)。其过程如下图所示,其中①~⑨表示过程。亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸,质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成控制亮氨酸的合成,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。
限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ
识别序列和切割位点 5'-G↓GATCC-3' 5'-A↓GATCT-3' 5'-A↓AGCTT-3' 5'-T↓CTAGA-3'
(1)以胞内的mRNA为模板通过反转录合成cDNA,将其储存于受体菌群,从而构建　　　　　　　　　　。过程②需要的限制酶是　　　　　　　　　　。
(2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞,质粒S中用作标记基因的是　　　　　　　　　　　　　　　　。为达到筛选目的,培养基的营养成分中不应含有　　　　　　　。将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出　　　　　　　(填“显示”或“不显示”)绿色荧光的细胞用于过程⑤。
(3)过程④常用仪器为　　　　　　　　　　　　。培养过程中需对早期胚胎进行性别鉴定和胚胎分割,性别鉴定应取　　　　　　　　　　(填“滋养层”或“内细胞团”)进行SRY-PCR,筛选出雌性动物胚胎并进行分割,分割时应注意　　　　　　　　。
4.(2022山东威海二模)COR基因是植物的冷调节基因,其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害,具有增强植物抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游靶基因启动子区,从而激活COR基因的表达,以提高植物的抗寒性。将不同植物中获取的CBF基因和COR基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,转入植物体内能有效提高植物的低温耐受性。构建基因表达载体时需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶,当遇到平末端和黏性末端不能连接时,可利用限制酶Klenow酶特有的5'→3'DNA聚合酶活性,将黏性末端补平后再与平末端连接。
(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段,根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B,则在PCR反应过程中需要经过　　　次复制才会出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物;经过四次循环形成的产物中同时含有A引物和B引物的DNA占　　　。
(2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子(每种组织器官中均发挥作用)、组织特异型启动子(特定组织器官中才能发挥作用)和诱导型启动子(特定条件刺激下才能发挥作用),构建基因表达载体时可单独使用某一类型的启动子,也可组合使用多种类型的启动子。从减少物质和能量消耗的角度出发,最好选择　　　　　　　　　　　　　　　　　　,使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。
(3)为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端,目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。根据下图所示的限制酶切割位点和识别序列,在实验室中构建抗寒基因超量表达载体时,为实现经XbaⅠ切割后的CBF基因与COR基因表达载体的连接,应选用的限制酶是　　　　　　　。
(4)转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后,可能与　　　　　　　　酶结合形成复合体,从而激活COR基因的表达。
(5)科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后,筛选到一个AtNUP160基因突变的植株(atnup160突变体),已知AtNUP160基因的表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA的出核转运,在植物的抗寒过程中发挥着重要的作用。研究发现,atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低,进而影响了COR基因的表达,导致植物的抗寒能力减弱。由此推断atnup160突变体抗寒能力减弱的机理是:
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
5.(2022山东青岛一模)研究发现,斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型,科研人员构建了以Gamma-crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp,部分构建过程如图1所示),最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。
图1
(1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA,经　　　　　　　　过程获得cDNA,并以其为模板,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出gsdf基因的cDNA,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到　　　种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用　　　　　　　　双酶切的报告质粒载体中,最终通过一系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。
(3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力,将其置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间,可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2,字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。
图2
据图2推测,2A肽具有“自剪切”能力的原因是:　　　　　　　　。
(4)某同学认为,gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达,就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。
6.(2022山东青岛二模)基因定点突变是指按照特定的要求,使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图。图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。
甲
乙
(1)图甲所示的基因定点突变技术需要进行多次PCR,并对PCR的中间产物A、B进行纯化,据图分析,得到中间产物A、B需要的引物对分别是　　　　　　　　　　,至少要进行　　　轮循环。研究人员利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段,长度(kb)如下表所示,则图中基因敲除片段的长度为　　　,基因M1的长度为　　　。
底物 基因M A B
长度 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05
(2)基因M1进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2+,原因是　　　　　　　。鉴定PCR产物通常用　　　　　　　　　　　　　　法。
(3)研究人员将基因M1与Ti质粒重构前,需要在基因M1的C、D两端分别加上的黏性末端序列为　　　　　　。构建重组质粒过程所需要的酶有　　　　　　　　　。
(4)重组质粒能够完成转化作用的原理是:　　　　　　　　　　　　　　　　　。
7.(2022山东临沂三模)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为:①质粒线性化;②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因;③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶的作用下形成重组质粒;④将重组质粒导入受体细胞。
(1)过程①中需要用到的酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　。另外,利用　　　　　　　　处理也可以直接得到线性化质粒。
(2)据图分析,为保证扩增出所需的目的基因,引物A或引物B要依据　　　　　　　　　的碱基序列进行设计。过程②经过　　　轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。
(3)过程③中,同源序列1、2的碱基排序不同,这样设计的好处是　　　　　　　　　。图示In-Fusion技术可作为模型使用,一般来说只需要改变图中的　　　　　　　　　　　　　　,即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。
(4)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因,以大肠杆菌作为受体细胞时,过程④需要用　　　　　处理大肠杆菌。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果,在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间后,分别用显微镜计数法和　　　　　　　　　　法进行计数,若计数结果分别是M、N,则致死率可用(M-N)/M×100%表示,此结果较真实值偏大,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
8.(2022山东淄博二模)由于乳酸菌难以在高密度下培养,研究人员将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酵母菌,通过酵母菌发酵生产乳酸。回答下列问题。
图1
图2
(1)采用PCR获取LDH时所用的引物是　　　　　　　　　　　　　　,该过程中引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)将LDH基因插入质粒前,用EcoRⅠ和ApaⅠ酶切质粒和LDH,双酶切的优点是:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,将LDH连接在质粒上所用的酶是　　　　　　　　　　　　　　。
(3)首先将基因表达载体导入大肠杆菌并进行筛选,筛选时培养基中应加入　　　　　　　　　　。再将含有的基因表达载体的大肠杆菌与酵母菌置于电转杯中,通过电激将目的基因表达载体导入酵母菌。质粒在酵母菌中不会随着酵母菌的增殖而丢失,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)图2是酵母菌发酵过程中乳酸含量的变化。在培养时间超过100 h后,乳酸浓度不再上升,主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为提高乳酸的生产效率,连续发酵时添加新培养基的最长周期为　　　h。
6.基因工程类大题突破
1.答案:(1)引物的3'端　目的基因fabV两端的碱基序列　使fabV基因受热变性后解旋为单链
(2)稀释涂布平板　三氯生　大肠杆菌属于原核生物,其DNA是裸露的,可以直接作为PCR模板,且PCR变性阶段的高温可直接杀死细菌,使其释放DNA
(3)P1→T1　P2→T2
解析:(1)Taq酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链,因此PCR扩增需要根据目的基因fabV的两端的碱基序列,按照碱基互补配对原则设计引物。反应体系的初始温度设置在90~95 ℃的目的是使目的基因受热变性后解旋为单链。(2)在步骤④中,需将大肠杆菌菌液利用稀释涂布平法接种到加有三氯生的细菌培养基上,进行筛选,能在该培养基上生长的菌株可能含有fabV基因。由于大肠杆菌属于原核生物,其DNA是裸露的,可以直接作为PCR模板,且PCR变性阶段的高温可直接杀死细菌,使其释放DNA,故PCR过程中不需要先提取细菌DNA。(3)C基因在低温下会抑制P1,说明启动子P1在高温下可以启动转录,R基因在高温下会抑制P2,说明启动子P2在低温下可以启动转录。又根据质粒示意图分析可知,转录方向是P1→C→R→T1和P2→T2。所以如果将lacZ基因和GFP基因插入质粒中,使其最后表现为低温下只表达GFP蛋白,而高温下只表达lacZ蛋白,则应该将lacZ基因插在P1→T1之间,将GFP基因插在P2→T2之间。
2.答案:(1)防止RNA酶降解RNA　耐高温的DNA聚合　将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3'端,合成DNA子链　5'
(2)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代　3　琼脂糖凝胶电泳
(3)不能　DGAT1基因在微藻细胞中不一定成功表达(或微藻细胞不一定产生TAG、微藻细胞出油率可能不高等)　使用化石燃料只会排放CO2,产油工程藻生产生物柴油需要以CO2为原料
解析:(1)从紫苏组织细胞中提取总RNA时,为避免RNA酶降解RNA,通常加入RNA酶抑制剂。将RNA逆转录合成的cDNA作为模板,PCR扩增DGAT1基因,反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶能将游离的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物3'端,进而合成DNA子链。为使DGAT1基因两端分别添加BamHⅠ和HindⅢ识别序列,需要将相应序列分别添加在两种引物的5'端。(2)为了让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,需要构建目的基因表达载体,这是基因工程的核心步骤。若只考虑DNA片段的两两连接,构建表达载体时可得到3种大小不同的连接产物,即目的基因自连、质粒自连以及目的基因和质粒相互连接,由于它们的分子量有差别,因此,可利用琼脂糖凝胶电泳方法将不同大小的DNA片段和连接产物分离,再将基因表达载体分离纯化,导入微藻细胞。(3)若鉴定微藻基因组中整合有DGAT1基因,不能说明高产油工程藻已生产成功,还需要检测DGAT1基因在微藻细胞中是否成功表达。“碳中和”的含义是通过计算CO2的排放总量,然后通过植树等方式把这些排放量吸收掉。与使用石油等化石燃料相比,生产使用生物柴油有利于实现碳中和,这是因为使用化石燃料只会增加排放CO2,产油工程藻生产生物柴油则需要以CO2为原料。
3.答案:(1)cDNA文库　BamHⅠ、HindⅢ
(2)基因Leu、基因GFP　亮氨酸　不显示
(3)显微注射仪　滋养层　将内细胞团均等分割
解析:(1)以胞内的mRNA为模板通过反转录合成cDNA,将其储存于受体菌群,从而构建cDNA文库;据图可知,目的基因两侧的黏性末端分别是5'-GATC-3'和5'-AGCT-3',故应选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ进行切割。(2)结合题意可知,质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成控制亮氨酸的合成,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白,故质粒S中用作标记基因的是基因Leu、基因GFP;由于基因Leu可控制亮氨酸的合成,故为达到筛选目的,培养基的营养成分中不应含有亮氨酸;基因GFP可以控制合成绿色荧光蛋白,而BamHⅠ会破坏该标记基因,则在重组质粒中该基因不能发挥作用,故将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出不显示绿色荧光的细胞用于过程⑤。(3)过程④是将目的基因导入动物细胞,常用方法是显微注射法,所用仪器是显微注射仪;由于滋养层将来发育为胎儿的胎膜和胎盘,故性别鉴定应取滋养层细胞;内细胞团将来发育为胎儿的各种组织,胚胎分割时应注意将内细胞团均等分割。
4.答案:(1)3　7/8
(2)块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导型启动子
(3)保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接(避免CBF基因和COR基因表达载体的自身环化以及CBF基因的反向连接)　SamⅠ、Klenow酶
(4)RNA聚合
(5)atnup160突变体中AtNUP160基因的表达产物减少,影响核孔复合体的形成,导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出细胞核,转录因子CBF减少,使得COR基因的表达水平明显降低,导致保护细胞免受冻害的亲水性多肽的含量减少,使植物的抗寒能力减弱
解析:(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段,根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B,则在PCR反应过程中需要经过3次复制才会出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物;经过4次循环,形成的产物共有24=16(个),其中含有亲代DNA分子母链的DNA分子共有2个,其他的DNA分子均共同含有引物A和引物B,则经过4次循环形成的产物中同时含有A引物和B引物的DNA占(16-2)/16=7/8。(2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子(每种组织器官中均发挥作用)、组织特异型启动子(特定组织器官中才能发挥作用)和诱导型启动子(特定条件刺激下才能发挥作用),构建基因表达载体时可单独使用某一类型的启动子,也可组合使用多种类型的启动子。为了达到减少物质和能量消耗的目的,应该选择块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导型启动子,使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。(3)为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端,这样可获得不同的黏性末端,保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接。根据图示限制酶切割位点和识别序列,在实验室中构建抗寒基因超量表达载体时,目的基因CBF的两端有两个限制酶MunⅠ和Xba Ⅰ的酶切位点,COR基因表达载体中有两个限制酶切点,其中MunⅠ和HedⅠ限制酶切割后能形成相同的黏性末端,在DNA连接酶的作用下可实现连接,而Xba Ⅰ切割CBF基因后形成的是黏性末端,无法与SmaⅠ切割后形成的平末端相连接,因此,需要在Xba Ⅰ切割CBF基因后利用限制酶Klenow酶特有的5'→3'DNA聚合酶活性,将黏性末端补平后再与SmaⅠ酶切割后形成的平末端连接。(4)转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后,可能与RNA聚合酶结合形成复合体,从而激活COR基因的表达,因为RNA聚合酶能启动基因的转录过程。(5)科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后,筛选到一个AtNUP160基因突变的植株(atnup160突变体),已知AtNUP160基因的表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA的出核转运,在植物抗寒过程中发挥着重要的作用。研究发现,atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低,进而影响了COR基因的表达,导致植物的抗寒能力减弱。题意显示,atnup160突变体中AtNUP160基因的表达产物减少,影响核孔复合体的形成,导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出细胞核,转录因子CBF减少,使得COR基因的表达水平明显降低,导致保护细胞免受冻害的亲水性多肽的含量减少,使植物的抗寒能力减弱。
5.答案:(1)逆转录　引物是根据gsdf基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与gsdf基因的cDNA特异性结合)
(2)3　EcoRⅠ、NotⅠ
(3)G与P之间未形成肽键
(4)不合理。要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交,若后代能够表达gsdf基因,(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立
解析:(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录,利用PCR技术扩增gsdf基因的cDNA,需要根据gsdf基因的一段已知序列设计引物,这样的引物能够在总cDNA中与gsdf基因的cDNA特异性结合,从而利用PCR扩增技术专一性扩增出gsdf基因的cDNA。(2)分析题图1可知,对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到3种不同的限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切的报告质粒载体中,最终通过一系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。(3)分析题意可知,将2A基因置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间,可以转录出一条mRNA,根据题图可知,翻译出gsdf蛋白之后,在G与P之间未形成肽键,继而开始合成egfp蛋白,从而避免这两个基因表达出一个融合蛋白。由此可知G与P之间未形成肽键是2A肽具有“自剪切”能力的原因。(4)要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交,若后代能够表达gsdf基因,(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。
6.答案:(1)引物1和引物3、引物2和引物4　2　0.23 kb
6.09 kb
(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活　琼脂糖凝胶电泳
(3)TCGA、ACGT　Hind Ⅲ、PstⅠ、DNA连接酶
(4)Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上
解析:(1)DNA复制时子链的合成方向为5'→3',因此引物的方向为5'→3',使用引物1和3可得到包含片段A的产物,使用引物2和4可得到包含片段B的产物;由于DNA进行半保留复制,使用引物1和3,进行一次PCR后,得到一个与基因M一样的片段,还得到一个含引物3的单链和一个长链的DNA片段,进行第二次PCR,得到4个DNA,其中有一个DNA片段,包含引物1和引物3,为图中的片段A,同理,片段B也可以经过两次PCR得到;图中↓表示酶切位点,基因M上有三个酶切位点,完全酶切产生4个片段,分别为3.24、2.8、0.15、0.13 kb,A片段酶切后的片段长度为2.8、0.09 kb,B片段酶切后的片段长度为3.24、0.05 kb,图中A片段和B片段的……是相同的,因此……处为0.05 kb,则基因M1为2.8+0.05+3.24=6.09(kb),基因M为3.24+2.8+0.15+0.13=6.32(kb),因此基因敲除片段的长度为6.32-6.09=0.23(kb)。(2)PCR是体外进行DNA复制的过程,DNA复制需要DNA聚合酶,真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2+;琼脂糖凝胶电泳通常用来鉴定PCR产物,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些,从而对不同大小的DNA片段进行分离。(3)结合重组质粒可知,基因M1的C端为HindⅢ、基因M1的D端为PstⅠ,因此需要在基因M1的C、D两端分别加上HindⅢ、PstⅠ的识别序列,结合两种酶的酶切位点可知,黏性末端序列为TCGA、ACGT;DNA连接酶可以将目的基因和质粒的黏性末端进行连接,催化磷酸二酯键的形成,连成重组质粒。(4)Ti质粒与目的基因形成重组质粒,Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上,完成转化过程。
7.答案:(1)Taq DNA聚合酶　限制酶
(2)目的基因和质粒　3
(3)防止目的基因反向连接;防止线性化质粒或目的基因的自身环化　引物A和引物B
(4)Ca2+　稀释涂布平板　在用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的是一个菌落
解析:(1)据图可知,过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程,该过程属于PCR技术的应用,故需要Taq DNA聚合酶;此外,也可利用限制酶切割相应的磷酸二酯键直接得到线性化质粒。(2)据图分析,目的基因经引物A或引物B扩增后需要与目的基因和线性化质粒连接,故为保证扩增出所需的目的基因,引物A或引物B要依据目的基因和质粒的碱基序列进行设计;根据DNA半保留复制的特点,可知PCR前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即仅含引物之间的序列,因此,至少经过3轮循环可得到符合要求的目的基因片段。(3)过程③是基因表达载体的构建过程,该过程中,同源序列1、2中的碱基排序不同,这样设计的好处是防止目的基因反向连接,防止线性化质粒或目的基因的自身环化,以保证目的基因能够正确连接并表达;引物是一段已知目的基因的脱氧核苷酸片段,故一般来说只需要改变图中的引物A和引物B,即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。(4)将目的基因导入微生物细胞时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易吸收环境中DNA分子的感受态;对微生物进行计数的方法有用显微镜计数法和稀释涂布平板法(用于活菌计数);若计数结果分别是M、N,致死率可用(M-N)/M×100%表示,在用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的是一个菌落,因此N偏小,进而导致此结果较真实值偏大。
8.答案:(1)引物①和引物④　定位目的基因的位置,与模板链结合,作为DNA聚合酶的作用起点
(2)防止目的基因(LDH)和质粒的自身环化,有利于目的基因(LDH)在质粒上正向连接　T4 DNA连接酶
(3)氨苄青霉素　质粒上含有真核生物的复制原点,能在酵母菌中复制
(4)乳酸浓度过高导致pH下降,抑制酵母菌生长　60
解析:(1)由图可知,采用PCR技术扩增LDH需要的引物是引物①和引物④,原因是DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,而不能把单个的脱氧核苷酸连接在一起。该过程中引物的作用是定位目的基因的位置,与模板链结合,作为DNA聚合酶的作用起点。(2)由图可知,质粒的启动子和终止子之间存在EcoRⅠ和ApaⅠ的酶切位点,将LDH基因插入质粒前,可用EcoRⅠ和ApaⅠ酶切质粒和LDH,为保证扩增出的LDH以正确的方向插入质粒,需要利用双酶切技术,双酶切的优点是可以防止目的基因和质粒的自身环化,有利于目的基因(LDH)和质粒的正向连接。将LDH连接在质粒上所用的酶是T4 DNA连接酶,因为EcoRⅠ酶切出的是黏性末端,而ApaⅠ酶切出的是平末端。(3)首先将基因表达载体导入大肠杆菌并进行筛选,由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,筛选时培养基中应加入氨苄青霉素。再将含有的基因表达载体的大肠杆菌与酵母菌置于电转杯中,通过电激将目的基因表达载体导入酵母菌。质粒在酵母菌中不会随着酵母菌的增殖而丢失,原因是质粒上含有真核生物的复制原点,能在酵母菌中复制。(4)由图可知,在培养时间超过100 h后,乳酸浓度不再上升,其主要原因是乳酸浓度过高,导致pH下降,抑制酵母菌生长。为提高乳酸的生产效率,连续发酵时添加新培养基的最长周期应为60 h,因为在60 h之前,酵母菌产生乳酸的效率较高,60 h之后效率降低,100 h之后基本不再产生乳酸。

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