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高三生物二轮复习专题突破
专题八　生物技术与工程
&核心知识梳理
选择性必修3 P5～6
1.某些种类的细菌会在营养缺乏或代谢产物积累的环境中形成没有繁殖功能的休眠构造，称为芽孢。
2.在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。
3.通常人工种子包括体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。其最外层为有机的薄膜包裹(人工种皮)，中间含有体细胞胚萌发所需要的营养成分和植物激素(人工胚乳)，最里面是体细胞胚等。
选择性必修3 P123
4.基因治疗是指向有基因缺陷的细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
1.下列是关于微生物的培养与培养基的相关叙述，请判断正误
(1)“细菌喜荤”，是说细菌培养基中要含有较高的有机氮。(√)
(2)利用LB液体培养基和LB固体培养基分别进行分离培养和扩大培养微生物。(×)
(3)配制培养基在制作棉塞时应使用脱脂棉，不能用普遍棉花。(×)
(4)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。(√)
(5)平板划线法简单并且可以用来计数，稀释涂布平板法使单菌落更易分开，但操作复杂些。(×)
2.按照生物类型的不同，细胞工程可分为植物细胞工程和动物细胞工程等。请判断下列有关细胞工程叙述的正误：
(1)植物组织培养过程中，需要对外植体进行高压蒸汽灭菌，以提供无菌的条件。(×)
(2)植物体细胞杂交就是利用一定的方法将去除细胞壁的不同来源的植物细胞融合为杂种细胞的过程。(×)
(3)取一定大小的茎尖进行培养，再生的植株有可能不带病毒。(√)
(4)在酶解法降解植物细胞壁时，应在等渗溶液中进行，以防止原生质体失水死亡。(×)
(5)培养液中的海拉细胞，生长到表面相互接触时，通常会停止分裂增殖，称为接触抑制。(×)
(6)动物细胞融合只能在同种生物的不同细胞间进行。(×)
(7)杂交瘤细胞不仅能分泌特异性抗体，而且还能无限增殖。(√)
(8)单克隆抗体具纯度高、特异性强、灵敏度高且可大量制备的优点。(√)
3.判断下列关于基因工程叙述的正误：
(1)基因工程通过在分子水平对基因进行直接操控，打破常规育种难以突破的物种间的界限。(√)
(2)细菌自身DNA经过相应的化学修饰，因而不会被自身的限制酶破坏。(√)
(3)载体能与外源DNA相连接并将其送入受体细胞中进行扩增。(√)
(4)启动子位于基因上游，有DNA聚合酶结合的位点，控制复制的开始。(×)
(5)不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。(√)
(6)电泳技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。(√)
(7)钙离子能增强细菌捕获外源DNA的能力，使之成为感受态细胞。(√)
(8)观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。(√)
(9)核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA。(×)
1.倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)和防止培养基水分过快蒸发
2.某同学在通过发酵制作果酒时，发现在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
在家庭中以葡萄为原料制作葡萄酒时，可以不添加酵母菌，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　糖可以为酵母菌的生长、繁殖提供能源物质，还可以作为酒精发酵的原料　葡萄皮上附着有大量的不同种类的野生酵母菌
3.在进行植物组织培养的实验时，要严格控制杂菌污染的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　杂菌可以在培养基上生长并争夺营养，杂菌产生的物质影响植物组织的生长
4.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的　　　　　　　　作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　抗盐基因(或目的基因)　将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
1.(2022·浙江6月选考，23)下列关于菊花组织培养的叙述，正确的是(　　)
A.用自然生长的茎进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒
B.培养瓶用专用封口膜封口可防止外界杂菌侵入并阻止瓶内外的气体交换
C.组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石带菌量低且营养丰富
D.不带叶片的菊花茎切段可以通过器官发生的途径形成完整的菊花植株
答案　D
解析　自然生长茎段的消毒属于外植体消毒，先用70%酒精，再用无菌水清洗，再用5%次氯酸钠消毒处理，最后再用无菌水清洗，A错误；培养瓶用专用封口膜封口的目的是防止杂菌污染，并不影响气体交换，B错误；组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石比较松软，持水性也较好，有利于幼苗的生根和叶片的生长，C错误；不带叶片的菊花茎的切段可通过植物组织培养分化出芽和根这种器官发生的途径形成完整的菊花植株，D正确。
2.(2021·浙江6月选考，20)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(　　)
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案　B
解析　进行胚胎体外培养过程中，不同发育阶段需要不同成分的培养液，其目的是促进细胞分化，以培养不同时期的胚胎，A正确；小鼠受精卵应在体外培养至桑葚胚，再植入同期发情小鼠的子宫，B错误；胚胎干细胞中均含有EGFP基因，分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠，C正确；将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，能表达EGFP的胚胎均含Y染色体，即为雄性小鼠胚胎，D正确。
3.(2022·浙江6月选考，29)回答下列(一)、(二)小题：
(一)回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80 ℃的________中保温一段时间，其目的是________________________。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过________后再筛选获得，或利用转基因、________等技术获得。
(二)回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(1)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的________检测。
(2)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的________，分析染色体组型是否改变进行判断。
(3)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为________时全能性表达能力最高。
答案　(一)(1)无菌水　水浴　杀死不耐热微生物　(2)分离　KI－I2　(3)人工诱变　原生质体融合
(二)(1)农杆菌　过低　敏感性　(2)再生　细胞核　形态特征和数量　(3)培养时间　受精卵
解析　(一)(1)产生淀粉酶的枯草杆菌的最适生长温度为50～75 ℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80 ℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。(2)将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI－I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。(3)要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
(二)(1)野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T－DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T－DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。(2)转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。(6)植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。
微专题1　发酵工程
1.培养基相关考点盘点
　培养基一般采用高压蒸汽灭菌，金属器具一般采用灼烧灭菌，受热易分解的尿素和易焦糊的葡萄糖等需用G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌。
2.微生物与发酵工程相关考点盘点
3.分离与纯化微生物的两种方法
4.能分解尿素的微生物的分离与计数
考向1　考查无菌操作及单菌落分离技术
1.(真题重组)回答下列关于无菌操作和单菌落分离的相关问题：
(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从________________________时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用________方式可较快地进行过滤除菌。(2018·浙江11月选考，32节选改编)
(2)[2017·浙江4月选考32(一)(1)]制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用________蘸取少量的稀释液，在MRS 乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是________。
答案　(1)达到设定的温度或压力值　抽滤
(2)接种环　B
解析　(1)由于高压蒸汽灭菌锅的升温升压需要一定时间，而未达设定温度和压力将导致灭菌不彻底，因此对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，如尿素培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中过滤除菌，采用抽滤方式可加快过滤速度。(2)获得单菌落时应在固体培养基平板上连续划线如图B所示。
考向2　考查微生物菌种的筛选与分离
2.[2018·浙江11月选考，32(一)(2)(3)]
(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加________________的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是________。
(3)为筛选胞外α－淀粉酶分泌型菌种，一般从________(A.果园树下　B.肉类加工厂周围　C.米酒厂周围　D.枯树周围)获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个________________比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取________用于检测酶活性。
答案　(2)将淀粉分解成单糖　作为碳源
(3)C　水解圈直径与菌落直径　上清液
解析　(2)相比果醋制作中先利用葡萄糖进行酒精发酵，再进行醋酸发酵，以淀粉为原料制醋，需增加淀粉分解成单糖的过程。醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是作为碳源。(3)结合生物具有适应性的规律，米酒厂周围的淀粉量相对较多，因此存在可分泌α－淀粉酶的分泌型菌种。分泌的α－淀粉酶活性越高，数量越多，菌落周围的透明水解圈越大。由于水解圈越大，表明淀粉分解量越多，因此水解圈直径与菌落直径比值大的菌落，分泌的酶活性较高。经液体培养基振荡培养进行扩增后，再将培养液离心，菌种会分布于沉淀，而分泌的胞外酶分布于上清液，可取上清液测定酶活性。
考向3　考查果酒、果醋及泡菜的制作
3.[2017·浙江11月选考，32(一)节选]回答与酿酒和制醋有关的问题：
(1)为了获得优良的酿酒红曲霉菌株，将原菌株的孢子诱变处理后制成较稀浓度的单孢子悬液，这样做的目的是在培养时有利于获得________。
(2)大米经蒸煮、红曲霉菌糖化后，用某酿酒酵母进行酒精发酵，发酵完毕后得到新鲜红曲酒，酒中乙醇浓度不超过15%。其主要原因是当发酵液中的乙醇浓度接近15%时，________(A.乙醇氧化逐渐增强直至平衡　B.葡萄糖分解逐渐增强直至平衡　C.乙醇氧化逐渐减弱直至停止　D.葡萄糖分解逐渐减弱直至停止)。
(3)影响红曲酒风味的主要因素，除了温度、pH、氧气等环境因素外，还有_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出2点即可)。
(4)在红曲醋生产工艺中，将适量的红曲酒、水和醋化醋杆菌等混合，再添加一定量谷壳糠等制成松散的发酵料，其主要目的是________，以利于醋酸发酵。
答案　(1)单菌落
(2)D
(3)不同的菌株、不同的原料
(4)增加通气性
解析　(1)在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，即单菌落。(2)乙醇浓度接近15%时，抑制了酵母菌的存活，可推知葡萄糖的分解会逐渐减弱直至停止。(3)酿酒过程中，除了温度、pH、氧气等环境因素外，还有酿酒原料、菌种活性、糖含量、杂菌污染、次级代谢产物等都会影响酒的风味。
(4)酿醋过程中，添加一定量谷壳糠等制成松散的发酵料，可在发酵过程中为醋酸发酵积存氧气，松散有利于空气流通。
4.(真题重组)回答与泡菜制作有关的问题：
(1)用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生________，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是____________________。(2020·浙江1月选考，29节选)
(2)用白萝卜制作泡菜的过程中，采用适当方法可缩短腌制时间。下列方法中错误的是________(2021·浙江1月选考，10)
A.将白萝卜切成小块
B.向容器中通入无菌空气
C.添加经腌制过的泡菜汁
D.用沸水短时处理白萝卜块
(3)泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使________菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使________菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。(2020·浙江1月选考，29节选)
(4)从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行________，再用________的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有________，以便于观察是否产酸。(2020·浙江1月选考，29节选)
(5)自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加________。(2020·浙江1月选考，29节选)
答案　(1)果胶酶　细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质
(2)B　(3)喜好氧的　不耐酸的
(4)稀释　涂布分离　酸碱指示剂　(5)乙醇
解析　(1)用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。(2)泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌，在无氧条件下乳酸菌厌氧呼吸产生乳酸，乳酸菌是异养厌氧型菌，因此向容器中通入无菌空气会对发酵产生抑制作用；将白萝卜切成小块可以增大发酵菌和萝卜的接触面积，有利于发酵；已经腌制过的泡菜汁中含有已经扩增的发酵菌，可以减少腌制时间；用沸水短时处理白萝卜块可以破坏萝卜的细胞膜，有利于发酵，故应选B。(3)泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。(4)从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。(5)自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
考向1　全面考查微生物培养利用中的无菌技术及分离计数
1.(2021·衢州高三质检)测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基(EMB培养基)上培养→统计菌落数目。流程示意图如下图所示。其中，指示剂伊红美蓝可使大肠杆菌菌落呈现紫黑色。请据图回答问题：
(1)过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，均需要进行灭菌处理，与过滤有关的操作都要在超净台上酒精灯火焰旁进行。待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为：在无菌条件下用________冲洗滤杯，并再次________。
(2)将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的________操作。从物理状态角度分析，EMB培养基属于________培养基，为检
测培养基灭菌是否彻底，对于固体培养基应采用的检测方法是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10 mL待测水样加入到90 mL无菌水中，稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为84，紫黑色菌落数平均为21，则推测1 L待测水样中的大肠杆菌数目为________。
(4)在配制尿素培养基的过程中，由于尿素具有________的特性，导致其无法使用高压蒸汽灭菌法灭菌，通常通过选用合适________的滤膜代替G6玻璃砂漏斗，也可达到去除尿素溶液中杂菌的目的。
答案　(1)无菌水　过滤　(2)接种　固体　将未接种的培养基在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生
(3)2 100　(4)受热会分解　孔径
解析　(1)有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，为了将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上，可以在无菌条件下用无菌水冲洗滤杯，并再次过滤。(2)完成过滤之后的滤膜上含有所需的菌种，滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于接种。从物理状态角度分析，EMB培养基属于固体培养基。将未接种的培养基在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生，可检测培养基灭菌是否彻底。(3)将10 mL待测水样加入到90 mL无菌水中，紫黑色菌落数为大肠杆菌的菌落，平均为21，因此，原来10 mL大肠杆菌的数目为21个。推测1 L(1 000 mL)待测水样中的大肠杆菌数目为2 100个。(4)尿素受热会分解，因此不宜使用高压蒸汽灭菌。通常通过选用合适孔径的滤膜代替G6玻璃砂漏斗，对尿素进行过滤除菌。
考向2　借助目标菌种的选育，考查社会责任
2.(2022·稽阳联谊)草莓是春节市场上非常受欢迎的一种水果，但却存在易腐烂、难保存的问题。某科研团队为了确定腐烂草莓上的菌种类型和探究草莓的新产业开发模式，进行了以下一系列的研究。请回答：
(1)科研团队用棉签刮取腐烂的草莓表面，然后用________冲洗棉签获得菌悬液，然后利用________法将其接种至LB固体培养基中，培养基中出现了均匀分布的单菌落。
(2)腐烂的草莓非常软烂，原因是微生物产生的________作用后使草莓组织更加松散。为了获得使草莓变软的微生物，用接种环分别刮取LB培养基上菌落的菌种，接种到________培养基上，发现了以下两种情况：
①LB培养基中的菌落数量和种类更多，原因是____________________________
____________________________________________________________________。
②后者培养基上的菌落与在LB培养基上培养时相比，生长状况不尽相同，可能原因是_____________________________________________________________。
(3)科研团队为了制成草莓果酒，将草莓放入榨汁机制成黏稠的果酱，然后接种酿酒酵母进行发酵，结果发现酒精含量低，且极易造成污染。可以将果酱进行________处理后再用于发酵。
答案　(1)无菌水　稀释涂布平板
(2)果胶酶　以果胶为唯一碳源的　草莓腐烂处的微生物并非都能产生果胶酶(其他合理答案也可)　菌种对营养物质的需求不同，导致生长状况不同
(3)稀释和灭菌
解析　(1)需要用无菌水冲洗刮取过腐烂草莓表面的棉签，制成菌悬液，避免其他杂菌的干扰。(2)果胶酶的作用使果胶含量减少会导致组织变软；草莓腐烂表面的微生物不一定都能产生果胶酶，需要将LB培养基上的菌落分别接种到以果胶为唯一碳源的培养基上进行筛选；能产生果胶酶的微生物常见的有细菌和真菌，真菌对培养基的偏好是“素”，也就是要求C/N较高，因此在以果胶为唯一碳源的培养基上的生长状况比LB培养基上更好。(3)黏稠的果酱有机物含量高，易被微生物污染，且黏稠的环境不易使酵母菌对营养成分的利用，导致酒精含量低，因此可以进行稀释和灭菌处理。
考向3　关注传统发酵技术，考查果酒、果醋及泡菜的制作
3.(2022·湖丽衢质检)苹果醋是一种酸性发酵健身饮料，含有丰富的维生素、无机盐、氨基酸和有机酸类，风味独特，深受广大消费者欢迎。在苹果醋生产中，醋酸菌的性能对产品质量、发酵效率有很大影响。研究者为了从醋酸菌中选出优势高产的菌种，做了相关实验，部分实验结果如下表所示。醋酸菌因产生醋酸溶解了培养基中的碳酸钙，而使菌落周围产生透明圈。回答下列问题。
菌株编号 透明圈直径/mm 菌落直径/mm
A1 3.5 1.5
A2 1.5 0.9
A3 7.0 1.8
A4 6.5 3.2
(1)菌株培养过程中需要对各种用具进行灭菌，置于超净工作台上的用具可利用________灭菌30分钟。
(2)依据菌落的________(答出2点)等特征筛选出四株可能是优势高产的菌株(A1、A2、A3和A4)，并采用________法来进一步纯化这些菌株。筛选的菌株接种于斜面培养基后，置于________中临时保存。根据表中实验结果，可以选取________菌株用于生产。
(3)用筛选出的高产醋酸菌制作苹果醋，当苹果酸和醋酸等总酸浓度不再增加时，其原因可能是________(答出2点)。
(4)在苹果醋工业生产过程中，除考虑上述条件外，还需考虑温度、pH和________等外界因素。
答案　(1)紫外灯(和过滤风)
(2)大小、形状、颜色和边缘与表面光滑与否
　平板划线法或稀释涂布平板　4 ℃的冰箱　A3
(3)乙醇消耗完毕；酸度过高抑制醋酸菌的代谢活动
(4)溶解氧
解析　(1)菌株培养过程中需要对各种用具进行灭菌，置于超净工作台上的用具可打开紫外灯灭菌30分钟，并开启过滤风。(2)每一种细菌在一定条件下都会形成固定的菌落特征，可依据菌落的大小、形状、颜色和边缘与表面光滑与否等特征筛选出四株可能是优势高产的菌株(A1、A2、A3和A4)，并采用平板划线法或稀释涂布平板法来进一步纯化这些菌株。筛选的菌株接种于斜面培养基后，置于4 ℃的冰箱中临时保存。根据表中实验结果，表格中透明圈直径与菌落直径比值最大的菌株是A3，故可以选取A3菌株用于生产。
(3)用筛选出的高产醋酸菌制作苹果醋，当苹果酸和醋酸等总酸浓度不再增加时，其原因可能是乙醇消耗完毕或酸度过高抑制醋酸菌的代谢活动。(4)醋酸菌是好氧菌，在苹果醋工业生产过程中，除考虑上述条件外，还需考虑温度、pH和溶解氧等外界因素。
4.(2022·绍兴适应性考试)研究表明，成品泡菜中含有丰富的乳酸菌资源，包括明串珠菌属、乳杆菌属等多个属。从泡菜中筛选出产酸耐酸能力较强的乳酸菌，可用于其他生产行业。回答下列问题：
(1)泡菜在发酵过程中表现出明显的菌群更替现象。发酵早期，随着发酵瓶中氧气耗尽，明串珠菌属由于具有复活迅速、________快等特点，迅速成了优势菌群；随着发酵持续进行，乳杆菌属由于________能力更强，逐渐在后期取代明串珠菌，成为优势菌群。
(2)选取发酵后期且风味良好的农家泡菜，用无菌移液器吸取适量泡菜汁液转移至经________的采样瓶中，零上低温保存并运回实验室。将样品进行梯度稀释后用移液器和________接种到含有溴甲酚紫的BCP培养基中进行选择培养，部分菌落周围出现黄色包围圈，溴甲酚紫的作用是作为________。选取上述菌落中的菌种，分别接种到MRS液体培养基中37 ℃培养24 h，测定并选取________较低的多组菌液，分别在人工胃液中培养，统计各组培养前后样本中的________，选出目标菌种。
(3)产酸耐酸性能优异的乳酸菌株应用广泛，适合用于制作益生菌饲料，其理由是一方面这些菌株更耐受胃的酸性环境，另一方面________________________。
答案　(1)增殖(繁殖)　耐酸　(2)灭菌　涂布器　(酸碱)指示剂　pH　活菌数
(3)产酸能力强，能更好抑制(胃)肠道内病原菌
解析　(1)氧气耗尽，好氧菌不能存活，明串珠菌可以在无氧或有氧条件下生长，具有复活迅速、繁殖快等特点；乳酸菌是厌氧菌，厌氧呼吸产生乳酸，后期酸性增强，乳酸菌耐酸能力强，因此逐渐成为优势菌群。
(2)要分析泡菜中的菌种，需排除其他菌的干扰，因此对采样瓶需进行高压蒸汽灭菌，即选取发酵后期且风味良好的农家泡菜，用无菌移液器吸取适量泡菜汁液转移至经灭菌的采样瓶中，稀释涂布平板法是分离鉴定菌种的一种方法，其特点是常需进行稀释，而后将稀释液用涂布器接种到固体培养基上；溴甲酚紫作为酸碱指示剂，如产生酸性，可使菌落周围呈现黄色包围圈；要进一步分离菌种，需选取pH较低(含有产酸多，耐酸强的菌种)的MRS培养液进行进一步培养；转移至人工胃液，比较各组样本中的活菌数，选出目标菌种(活菌数多的)。
(3)产酸耐酸性能优异的乳酸菌株不仅耐酸能力强，而且产酸能力强，能更好抑制(胃)肠道内病原菌，是制作益生菌饲料的良好菌种。
微专题2　细胞工程
1.细胞工程中的三大培养基
2.动物细胞培养与植物组织培养的比较
3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别
　灭活病毒诱导法是诱导动物细胞融合的特有方法，不适合用于诱导植物原生质体融合。
4.单克隆抗体的制备
　①单克隆抗体具有四大优点——纯度高、可大量制备、特异性强、灵敏度高；②单克隆抗体的三大用途——诊断试剂、运载药物和治疗疾病。
5.理解受精作用和早期胚胎发育过程
6.熟练掌握胚胎工程的主要技术手段
考向1　围绕植物细胞工程，考查科学思维
1.(真题重组)回答下列与植物克隆有关的问题：
(1)利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间________，且不经历________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月选考，29节选)
(2)与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如________(A.提高蔗糖浓度　B.降低培养基浓度　C.提高大量元素浓度　D.不添加琼脂)。(2020·浙江7月选考，29节选)
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。(2019·浙江4月选考，32节选)
答案　(1)短　脱分化　(2)生长素　根的分生组织　B　(3)变异　高浓度致病真菌　花粉离体
解析　(1)利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程所需时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。(2)植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的植物激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根，比较发芽培养基和生根培养基可知降低培养基的浓度可促进生根。故选B。(3)抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选。
考向2　围绕动物细胞工程，考查生命观念
2.(真题重组)为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，下图为相关细胞培养过程示意图。
(1)步骤①的操作________(填“需要”或“不需要”)在无菌环境中进行(2021·6月浙江选考，18A)
(2)步骤②中需要________溶解细胞间物质使细胞分离，以制备细胞悬浮液。(2021·6月浙江选考，18B)(2021·1月浙江选考，29节选)
(3)步骤③的培养称为________，步骤④的培养称为________，从步骤③到④的分瓶操作前常用________处理(2021·6月浙江选考，18C)(2021·1月浙江选考，29节选)
(4)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体制备的过程________(填“需要”或“不需要”)用到上述动物细胞培养技术。
答案　(1)需要　(2)胰蛋白酶或胶原蛋白酶
(3)原代培养　传代培养　胰蛋白酶
(4)B淋巴　需要
解析　(1)步骤①的操作需要在无菌环境中进行。
(2)步骤②中需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶溶解细胞间物质使细胞分离，以制备细胞悬浮液。
(3)步骤③的培养称为原代培养，步骤④的培养称为传代培养，从步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理。
(4)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体制备的过程需要用到上述动物细胞培养技术。
考向3　围绕胚胎工程，考查生命观念
3.(2020·浙江1月选考，17)下列关于利用胚胎工程培育优质奶牛的叙述，正确的是(　　)
A.从雄性奶牛中采集到的成熟精子遇到卵子即可进入卵子内
B.在体外完成受精后的受精卵，将其植入子宫即可完成着床
C.随着卵裂的进行，卵裂球细胞的体积变小，卵裂球的体积和有机物总量显著增加
D.在含有经辐射处理的胚胎成纤维细胞的培养体系中，胚胎干细胞不易发生分化
答案　D
解析　成熟的精子获能后方可受精，A错误；在体外完成受精后的受精卵，若要植入子宫，需要先培养至桑葚胚或囊胚，受精卵无着床能力，B错误；在卵裂期，卵裂球的体积基本不变，细胞的体积由于细胞数的增多而减小，有机物总量减少，C错误；经射线照射丧失增殖力的胚胎成纤维细胞可抑制胚胎干细胞的分化，D正确。
考向1　结合基因工程，考查植物细胞工程的应用
1.(2022·湖丽衢质检)红花草莓兼有观赏性和食用性。研究人员对红花草莓的离体繁殖及再生植株体系开展了研究。请回答下列问题。
(1)红花草莓的匍匐茎尖具有顶端分生组织，可以不经________阶段，直接萌生出丛状苗，因此实验时常作为外植体使用。为避免外植体组织内的杂菌污染，可在培养基中添加一定量的________。
(2)试管苗在初代培养基上培养一段时间后需要进行继代培养，原因是________________________。当丛状苗繁殖到一定数量时，需要将其移入________培养基。对比上述各种培养基的成分，最关键的区别在于________的浓度和配比不同。取上述草莓无菌苗的叶片为外植体，在叶片伤口处形成愈伤组织，再经愈伤组织生芽生根，这种再生植株途径称为________途径。
(3)为提高红花草莓的耐低温能力，研究人员拟将青稞抗寒基因(dhn4)导入红花草莓，常用的方法有2种：①将含有重组DNA分子的________与无菌草莓叶块共同培养完成侵染；②用________法直接将重组DNA分子导入草莓原生质体。
答案　(1)愈伤组织/脱分化　抗生素
(2)培养基中营养物质枯竭、代谢产物积累　生根　植物生长调节剂(或植物激素)　器官发生
(3)农杆菌　显微注射
解析　(1)红花草莓的匍匐茎尖具有顶端分生组织，可直接诱导出幼芽，然后通过幼芽的快速繁殖出幼苗，因此不需要经过愈伤组织这个阶段。为避免外植体组织内的杂菌污染，可在培养基中添加一定量的抗生素抑制杂菌生长。
(2)试管苗在初代培养基上培养一段时间后营养物质消耗殆尽，代谢废物积累，因此需要进行继代培养。当丛状苗繁殖到一定数量时需要进行生根培养，需要生根培养基。诱导生根或者出芽就是植物生长调节剂浓度和配比不同。草莓无菌苗的叶片为外植体，在叶片伤口处形成愈伤组织，再经愈伤组织生芽生根，这种再生植株途径称为器官发生。
(3)①将目的基因导入植物体内选择农杆菌作为载体，②直接将重组DNA分子导入原生质体使用显微注射法。
考向2　结合动物细胞工程技术，考查单克隆抗体的制备
2.(2022·诸暨诊断)单克隆抗体因其靶向性强、特异性好等显著优点，在实践中应用广泛。
(1)早期单克隆抗体是利用已免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞________获得杂交瘤细胞来制备的，这些鼠源单克隆抗体进入人体，可能使人体产生与该抗体特异性结合的________，导致该抗体失效。
(2)多种技术可以解决抗体失效问题。如从杂交瘤细胞中提取编码鼠源单克隆抗体________(填“5区”或“6区”，抗体的结构如图所示)序列的基因，与从人体中获得的编码抗体________(填“5区”或“6区”)的基因进行拼接，然后导入骨髓瘤细胞中，进行培养获得新的抗体。
(3)采用相关技术破坏小鼠内源免疫球蛋白(Ig)基因，然后将含人免疫球蛋白(Ig)基因的重组DNA经显微注射技术导入小鼠________，然后将筛选后的受体细胞进行胚胎体外培养，再将其移植到同种、________的代孕母鼠体内，经分娩后培育、筛选获得能产生________的转基因小鼠，然后利用该小鼠进行单克隆抗体制备。
答案　(1)杂交　抗体
(2)5区　6区
(3)受精卵　同期发情　人免疫球蛋白
解析　(1)早期单克隆抗体的制备：利用已免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行杂交，获得杂交瘤细胞，这些鼠源单克隆抗体进入人体，对于人体来说，这些抗体就是抗原，可能使人体产生与该抗体特异性结合的抗体，导致该抗体失效。
(2)抗体和抗原特异性结合的区域是5区。引起人体免疫反应的主要是6区。据蛋白质工程流程，可以从人体中获取编码抗体6区序列的基因，然后从杂交瘤细胞中提取编码鼠源单克隆抗体5区序列的基因，对两种基因进行修饰、拼接，利用运载体将重组基因导入骨髓瘤细胞进行培养，获取人鼠嵌合抗体。
(3)构建人免疫蛋白转基因小鼠时，为避免小鼠细胞自身Ig基因表达而产生的免疫排斥，要选择自身Ig基因缺陷的小鼠受精卵细胞作为受体细胞，并通过显微注射操作导入重组DNA将经筛选后的受体细胞进行胚胎体外培养，再将胚胎移植到同期发情处理的代孕母鼠子宫内，经代孕母鼠分娩后培育、筛选获得人免疫球蛋白(Ig)转基因小鼠，利用该小鼠进行单克隆抗体制备，产生大量人免疫球蛋白。
考向3　结合胚胎工程技术流程，考查生命观念
3.(2020·全国卷Ⅲ，38)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
回答下列问题：
(1)步骤①中需要使用的工具酶有_______________________________________。
步骤②和③所代表的操作分别是________和________。步骤④称为________。
(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的____________(答出2点即可)的限制。
(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________________________________________________。
(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有____________(答出2点即可)。
答案　(1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶　显微注射　体外培养　胚胎移植　(2)性别、年龄　(3)相同　两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵
(4)体外受精、胚胎移植
解析　(1)步骤①是基因表达载体的构建过程，该过程需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶，用限制酶分别切割载体和目的基因，用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。步骤②和③所代表的操作分别是显微注射和体外培养。步骤④是将早期胚胎植入到代孕母体内，称为胚胎移植。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的性别和年龄的限制。(3)乳腺上皮细胞和膀胱上皮细胞都是体细胞。一般来说，在同一动物个体中，其体细胞都是由同一个受精卵分裂、分化而来的，细胞在分裂、分化过程中，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息一般是不变的，因此两种上皮细胞的染色体DNA所含的遗传信息相同。(4)据题述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技术有体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等。
微专题3　基因工程
1.基因工程的三大工具
2.基因工程的四个操作步骤
(1)获取目的基因
(2)利用表达载体构建重组DNA分子
　表达载体应包含适当的转录和翻译信号，如启动子、终止子。
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)检测目的基因及其表达产物
3.PCR技术
　①1个模板DNA分子经n轮扩增，共产生2n个DNA片段，共需引物2n＋1－2个；②经过第3轮扩增后，扩增出的含目的基因的DNA片段才不带黏性末端(占1/4)；③经过n轮扩增，扩增出的不带黏性末端的DNA片段所占比例为1－n·2(1－n)。
4.基因诊断与基因治疗的比较
5.基因工程与蛋白质工程的比较
考向1　考查获得目的基因的方法和重组DNA分子的形成
1.(真题重组)回答下列关于基因工程中目的基因获取与重组DNA分子形成的相关问题：
(1)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成________，导入到大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因，并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________________________________________________________
_____________________________________________________________________
(答出2点即可)。
提取质粒后，采用________法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。(2021·浙江6月选考，29节选)
(2)若要获得已知序列的抗病基因，可采用________或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用________，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中________，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。(2020·浙江1月选考，29)
(3)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。(2019·浙江4月选考，32节选)
(4)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBⅠ121均用限制性内切核酸酶EcoRⅠ酶切，在切口处形成________。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBⅠ121用DNA连接酶连接。在两个片段相邻处形成________，获得重组质粒。(2018·浙江4月选考，32节选)
(5)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。从兔肝细胞中提取mRNA，在________酶的作用下形成互补DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成________，再导入用氯化钙处理的________，侵染矮牵牛叶片。将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。(2016·浙江4月选考，32节选)
答案　(1)重组DNA分子　限制性内切核酸酶的识别序列、抗生素抗性基因　显微注射　(2)化学合成　两种限制性内切核酸酶　扩增　(3)单克隆抗体　基因组文库　
(4)黏性末端　磷酸二酯键　(5)逆转录　重组DNA分子　农杆菌
解析　(1)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成重组DNA分子，导入到大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因，并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有限制性内切核酸酶的识别序列、抗生素抗性基因等。将目的基因导入动物细胞可采用显微注射法。(2)可采用化学合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性内切核酸酶，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。(3)抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因组文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因组文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因。(4)用限制性内切核酸酶EcoRⅠ切割含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBⅠ121，可在切口处形成黏性末端。用DNA连接酶连接含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBⅠ121，可在两个片段相邻处形成磷酸二酯键，获得重组质粒。(5)以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录过程，这一过程需要在逆转录酶的催化下进行。获得目的基因后，需在限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用下，将目的基因与载体连接形成重组DNA分子，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，先将重组DNA分子导入经氯化钙处理的农杆菌，再用导入目的基因的农杆菌感染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植物。
考向2　考查将重组DNA分子导入受体细胞的方法和筛选含有目的基因的受体细胞
2.(真题重组)(1)天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段(T－DNA)，该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T－DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的________。(2020·浙江7月选考，29节选)
(2)结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。(2020·浙江7月选考，29节选)
(3)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成________实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(2018，浙江4月选考，32节选)
(4)将某种抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________(A.质粒载体　B.转录产物　C.抗性基因　D.病原微生物)。(2019·浙江4月选考，32节选改编)
答案　(1)抗性基因　(2)全能性表达充分　(3)转化　使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(4)B
解析　(1)设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因(如抗生素抗性基因)，在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。(2)转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性(细胞发育成个体的潜能)较高及易被农杆菌侵染等特点。(3)取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。(4)质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A错误；转录产物为RNA，可以通过DNA－RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D错误。
考向1　创设情景，考查基因工程的操作步骤
1.(2022·稽阳联谊)某种植物的根会产生一种次生代谢产物，该次生代谢产物具有很高的药用价值。在研究这种次生代谢产物合成的分子机制时发现，基因A表达沉默时才能产生，且有物质甲存在时会使基因A表达。物质甲在环境中非常常见，为了实现基因A的沉默，现设计将基因A反向连接到植物基因组中。基因A与Ti质粒结构如下图所示，箭头表示转录方向。
(1)为了使基因A反向连接到Ti质粒上，选用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶进行切割并分离获得A基因，然后加入________________形成重组Ti质粒。为了保证重组Ti质粒在农杆菌中稳定存在，需将工程发根农杆菌进行________________处理。
(2)将含有重组Ti质粒的发根农杆菌与经过创伤处理的外植体共同培养一段时间，然后进行________后，在培养基中加入________以筛选出成功导入基因A片段的植物细胞。再转移至含有____________的培养基上培养得到愈伤组织。结果发现未更换培养基的情况下，就长出了较多的根，可能原因是发根农杆菌的T－DNA中含有________基因。
(3)为了检验转基因是否成功，应在________(填“含”或“不含”)物质甲的培养液中将获得的根进行水培，发现只有部分能产生目标次生代谢产物。部分根无法产生次生代谢产物的可能原因是________________________。
答案　(1)DNA连接酶　除去EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶/限制酶/EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶基因/限制酶基因
(2)除菌(不能填灭菌)　潮霉素　适当配比的营养物质和植物生长调节剂　生长素合成酶/生长素合成相关
(3)含　反接的基因A未成功表达
解析　(1)由图可知，经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切割得到的目的基因不含启动子，需要借用T－DNA上的启动子才能顺利表达，T－DNA上的氨苄青霉素抗性基因上刚好有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶的酶切位点，能成功地将目的基因反向连接上，其转录后形成的mRNA与A基因正常转录形成的mRNA恰好互补，从而阻止A基因正常转录形成的mRNA的翻译过程；为了避免重组Ti质粒在农杆菌中被限制酶破坏，需将工程发根农杆菌进行除去EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶处理。
(2)将含有重组Ti质粒的发根农杆菌与经过创伤处理的外植体共同培养一段时间后，需要除去农杆菌，防止表面农杆菌在培养基上大量滋生；该过程中部分植株细胞完成了转化，获得了T－DNA上的潮霉素抗性基因，因此需要利用含有潮霉素的培养基来筛选完成转化了的植物细胞；转化后的植物细胞形成的愈伤组织在正常的MS培养基上生根旺盛，说明自身产生了较多的生长素，促进了愈伤组织生根，说明发根农杆菌的T－DNA中含有生长素合成的相关基因。
(3)自然条件下，次生代谢产物只有在基因A表达沉默时才能产生，且有物质甲存在时会使基因A表达，转基因后，由于反接的基因A转录出的mRNA与正常基因A转录的mRNA互补，因此即使含有物质甲，正常基因A的表达也会被沉默，因此可以作为目的基因是否成功起作用的标志；部分根无法产生次生代谢产物，说明目的基因未正常发挥作用，可能原因是反接的基因A未成功表达。
考向2　围绕基因工程的应用，考查社会责任
2.(2022·台州二模)镰刀形细胞贫血症是一种严重的遗传病，患者的红细胞在缺氧时变为镰刀状，容易堵塞血管，导致内脏及组织缺氧。科学家利用基因工程的原理设计了一套治疗方案，如图所示，回答下列问题：
(1)基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，为细胞补上________的基因或改变病变的基因，以达到治疗________的目的。
(2)腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。从人体细胞中获得正常基因后，可通过________技术进行扩增，再利用________把载体基因和正常基因连接起来，构建重组腺病毒载体，再让该病毒载体感染靶细胞。
(3)靶细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有________能力的细胞，这样才能使被转入的基因能长期有效地发挥治疗作用。因此病人的________是理想的转基因治疗靶细胞。
(4)经过基因工程改造的靶细胞可提取其DNA，根据________原则，通过核酸分子杂交技术进行检测。再将成功导入正常基因的靶细胞进行________培养，使之繁衍成一个新的细胞群体，然后回输到病人的骨髓中，以产生正常的血细胞。
答案　(1)丢失(缺陷)　遗传性疾病
(2)PCR　限制性内切核酸酶和DNA连接酶
(3)分裂(增殖)　造血干细胞
(4)碱基互补配对　克隆
解析　(1)基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，为细胞补上丢失(缺陷)的基因或改变病变的基因，以达到治疗遗传性疾病的目的。
(2)腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。从人体细胞中获得正常基因后，可通过PCR技术进行扩增，再利用限制性内切核酸酶和DNA连接酶把载体基因和正常基因连接起来，构建重组腺病毒载体，再让该病毒载体感染靶细胞。
(3)靶细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂(增殖)能力的细胞，这样才能使被转入的基因能长期有效地发挥治疗作用。因此病人的造血干细胞是理想的转基因治疗靶细胞。
(4)经过基因工程改造的靶细胞可提取其DNA，根据碱基互补配对原则，通过核酸分子杂交技术进行检测。再将成功导入正常基因的靶细胞进行克隆培养，使之繁衍成新的细胞群体，然后回输到病人的骨髓中，以产生正常的血细胞。

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