资源简介

[实验基础·自主学习]
1．实验原理
20%马铃薯蔗糖培养基的配方：去皮马铃薯丝(或小块)20 g，蔗糖2 g，琼脂1.5～2 g，水100 mL(自然pH)。
2．方法步骤
(1)计算：根据配方计算出配制培养基所需的马铃薯、蔗糖和琼脂的用量。
(2)配制20%马铃薯浸汁：取马铃薯去皮，称取所需量，切成丝或小块，加水至所需量。用酒精灯加热煮沸10 min后，用纱布过滤到500 mL三角瓶中，按所需量加入蔗糖，待其溶化后补足水至所需体积，摇匀。
(3)制备斜面、固体和液体培养基
液体培养基：将部分上述马铃薯浸汁分装到2个50 mL三角瓶中，每瓶约20 mL，封口。
斜面培养基：按需要量称取琼脂，将其加入上述500 mL的三角瓶中，加热溶化后，用玻璃漏斗将培养基分装到2支18 mm×180 mm的试管中，每支5～8 mL。
固体培养基：将用于制备斜面培养基后剩余的培养基分装到250 mL三角瓶中，封口。
将上述固体、液体和斜面培养基放入高压灭菌锅，在1 kg/cm2、121 ℃条件下灭菌20 min，灭菌后将斜面培养基摆成斜面。
(4)制作棉塞
用棉花制作试管棉塞时，要先确定棉塞的长度和粗细。棉塞长度要保证既塞住瓶口(进入瓶口约3～4 cm)，在瓶口外又要留有一定的长度(约2 cm)，方便在接种时用无名指、小拇指取下来；棉塞粗细也要适当，以不易脱落为度。
[实验关键·探究学习]
1．制备斜面培养基操作提示：①注意控制好温度，防止培养基提前凝固。②不要让培养基粘在试管口。③试管中的液体量约为试管长度的1/4。试管加棉塞后，用牛皮纸包好。
2．制作棉塞时值得注意的是，由于脱脂棉吸水后容易引起污染，所以制作棉塞应该使用普通棉花，而不能使用医用的脱脂棉。
[实验应用·对点练习]
将马铃薯去皮切块，加水煮沸至马铃薯软烂，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容后灭菌，得到马铃薯琼脂培养基。回答下列问题。
(1)马铃薯琼脂培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________ (答出两点即可)。
(2)分离培养酵母菌通常使用马铃薯琼脂培养基，该培养基在进行接种前要进行________。将酵母菌菌种划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是____________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)该培养基按物理性质划分属于________培养基，若要对酵母菌进行扩大培养，此培养基中不应加入的物质是________。
[解析]　(1)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(2)培养基在使用前常用高压蒸汽灭菌；菌落概念见答案。(3)该培养基中有凝固剂，属于固体培养基，若要对酵母菌进行扩大培养，此培养基中不应加入凝固剂。
[答案]　(1)碳源、无机盐　蛋白质、核酸
(2)(高压蒸汽)灭菌　分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
(3)固体　凝固剂第一节　微生物的培养需要适宜条件
课标内容要求 核心素养对接
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。 1.科学思维——根据微生物的代谢类型分析培养基的组成；认识无菌技术是获得纯净微生物培养物的重要方法。2.科学探究——讨论并掌握无菌技术的实验操作方法；尝试配制培养基培养酵母菌。
一、培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
1．微生物和无菌技术
(1)微生物是人们对所有形体微小、肉眼不可见的生物的统称。
(2)无菌技术：在培养某种微生物时，防止其他微生物混入，保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术称为无菌技术。
2．培养基
人们为满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的需求而配制的混合养料。
3．培养基的成分与细胞的化学组成及其在细胞代谢中的作用有关。
(1)水：培养基中含量最高。
(2)无机盐
①影响微生物细胞的吸水能力。
②影响微生物的代谢及生长。
(3)碳源：为微生物生长提供碳元素的物质。
(4)氮源：为微生物生长提供氮元素的物质。
(5)生长因子：由于自身的缺陷，有些微生物对培养基成分有特殊的需求，需要在培养基中有针对性地添加某些特定的维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机化合物才能生长，这些化合物统称为生长因子。
(6)微生物生活所需要的能量来源
①异养型微生物：培养基中的有机物。
②自养型微生物：光能或化学反应释放的能量。
4．培养基的理化特性影响微生物的生长。
(1)“细菌喜荤，霉菌喜素”
①细菌培养基中要含有较高的有机氮，因此常用蛋白胨和酵母提取物等来配制。
②霉菌培养基一般用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制。
(2)制备培养基时要注意调节培养基的pH
①细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长。
②霉菌要求在中性偏酸的环境中生长。
5．根据培养基的物理特征可以把培养基分成液体培养基和固体培养基等。
(1)液体培养基是没有添加凝固剂的培养基，常用于大规模快速繁殖某种微生物。
(2)固体培养基(solid medium)通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。
①“平板”：将灭菌后未凝固的固体培养基注入培养皿中，冷凝后制成的固体培养基简称为“平板”。常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等。
②“斜面”：将灭菌后未凝固的固体培养基注入试管，将试管斜放在台面上，培养基冷却后在试管中形成了一个斜面，这样的固体培养基简称为“斜面”，常用于菌种保存。
6．根据培养基的化学成分可以把培养基分成合成培养基和天然培养基等。
二、灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰
1．保证器具与培养基无菌是获得微生物“纯”培养物的基础。
(1)芽孢：某些种类的细菌会在营养缺乏或代谢产物积累的环境中形成没有繁殖功能的休眠构造，称为芽孢。
对于加热、紫外线照射和化学药物都具有极强的抵抗能力。
(2)消灭器具和培养基中可能存留的各种类型微生物的方式：高压灭菌。
2．使用高压灭菌锅灭菌时所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的。
(1)实例
①肉毒梭菌的芽孢：在pH 7.0的100 ℃沸水中要煮5.0～9.5 h才能被杀灭，当温度提高到115 ℃加压灭菌时，时间就能缩短到10～40 min，将温度提高到121 ℃时只需要10 min就能完成。
②保证外科手术器械无菌、安全：要在115 ℃下灭菌30 min或在121 ℃下灭菌10 min，这样才能杀死致病菌破伤风梭菌(Tetani)和产气荚膜梭菌(Perfringens)的芽孢。
(2)在微生物实验中用121 ℃(1 kg/cm2压力)对实验器具和培养基进行15～20 min的灭菌处理是比较安全的。
3．灭菌后，要将高压灭菌锅中的实验用具及培养基及时取出。
(1)培养基
①取出后，放入超净工作台。
②分装最好在超净工作台内的酒精灯火焰旁完成。
③分装时注意事项：不要让培养基黏附在三角瓶口、试管口、培养皿内壁上，以免在培养过程中非目标微生物从瓶口沿器皿内壁上的培养基向内生长而发生污染。
(2)实验器具
①取出后，放入60～80 ℃的烘箱中烘干，除去灭菌时高压蒸汽产生的水分以免金属器械锈蚀。
②在进行分装或接种操作前，将需要使用的、已灭菌的用具从烘箱中取出，放到超净工作台中，然后打开紫外灯和过滤风开关，灭菌30 min。
4．接种过程中，防止其他微生物进入培养基是获得纯培养物的关键环节。
(1)接种：将目标微生物转移到培养基中的过程称为接种。
(2)接种工具：涂布器、接种环等。
①接种环：用接种环接种前，要先将接种环的环部、金属丝、金属丝与柄的连接部、连接部的上端在明火上灼烧，使黏附在其表面的微生物在高温中炭化，待接种环冷却后再接种。
②涂布器：在使用涂布器接种时，应将涂布器浸泡在75%的酒精中。接种前将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，冷却后用于涂布。
(3)瓶口或试管口：在接种过程中，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
(4)接种时要靠近酒精灯的火焰，利用燃烧产生的上升气流减少空气中微生物落入培养基的可能性。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。 (×)
提示：液体培养基和固体培养基都含有水，它们的区别为是否含有凝固剂。
2．获得纯净微生物培养物的基础是保证器具与培养基无菌。 (√)
3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。 (×)
提示：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行灭菌。
4．培养基分装到培养皿后进行灭菌。 (×)
提示：培养基分装到培养皿之前要进行灭菌。
5．“平板”“斜面”都常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等。 (×)
提示：“平板”常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等，而“斜面”则常用于菌种保存。
6．将目标微生物转移到培养基中的过程称为接种。 (√)
　培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
1．培养基的成分及功能
营养要素 来源 功能
水 ①细胞中含量最高，培养基中含量最高的也是水②细胞的重要组成成分
无机盐 ①影响微生物细胞的吸水能力②影响微生物的代谢及生长
碳源 ①无机碳，如CO2②有机物 ①用于微生物构建自身有机物②对异养型微生物而言，有机物既是碳源又能满足它们对能量的需求
氮源 含氮化合物 用于微生物合成自身的蛋白质等有机物
生长因子 特定的维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机化合物 满足微生物生长对培养基成分的特殊需求
2.培养基的种类
分类标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理特征 固体培养基 “平板” 添加凝固剂，如琼脂 常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等
“斜面” 常用于菌种保存
物理特征 半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 不添加凝固剂 常用于大规模快速繁殖某种微生物
化学成分 合成培养基 化学成分完全清楚 一般用于在实验室进行的、要求可重复性强的各种研究工作
天然培养基 用化学成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成 除了在实验室常用外，更多地被用于大规模的生物发酵工业
1．能够利用无机碳源的微生物的同化作用类型是什么？
提示：能利用无机碳源的微生物的同化作用类型是自养型微生物。
2．牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能够提供哪些营养成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。
1．(2020·北京西城区高二下期中)下列有关培养基配制的描述，正确的是(　　)
A．液体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定
B．任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐等成分
C．是依据人们的需求，配制出的供微生物生长繁殖的营养基质
D．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、渗透压等影响
D　[固体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定，A错误；培养基不一定含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基不需加碳源，分离自生固氮菌的培养基不需加氮源，B错误；人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质叫培养基，C错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧气、渗透压等的影响，D正确。]
2．如表所示为某培养基的配方，下列叙述错误的是(　　)
成分 NaNO3 K2HPO4 MgSO4·7H2O (CH2O) 蒸馏水 青霉素
含量 3 g 1 g 0.5 g 30 g 定容至1 000 mL 0.1万单位
A．根据物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．根据用途划分，该培养基属于选择培养基
C．根据培养基的配方可知，该培养基培养的微生物的同化作用类型是异养型
D．固体培养基中加入少量水即可形成液体培养基
D　[固体培养基和液体培养基的区别在于是否加入凝固剂(如琼脂)，题表所示的培养基配方中没有琼脂，因此属于液体培养基，A正确、D错误；加入青霉素可分离得到酵母菌和霉菌等，因此该培养基属于选择培养基，B正确；该培养基中的(CH2O)可作为有机碳源，因此其培养的微生物的同化作用类型是异养型，C正确。]
　灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰
1．灭菌和无菌操作技术
(1)目的：保证得到的培养物就是所需要的微生物。
(2)获得微生物“纯”培养物的基础：保证器具与培养基无菌。
(3)方法
①除掉各种微生物简便易行的办法：加热。
②消灭器具和培养基中可能存留的各种类型微生物的方法：高压灭菌。
(4)使用高压灭菌锅灭菌
①灭菌时
a．所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的。
b．在微生物实验中用121 ℃(1 kg/cm2压力)对实验器具和培养基进行15～20 min的灭菌处理是比较安全的。
②灭菌后：要将实验用具及培养基及时取出。
③对含葡萄糖的培养基：采用适当降低温度、压力(112 ℃，500 g/cm2)以及延长时间(30 min)的高压灭菌方法灭菌。
④在全部培养工作结束后，所有使用过的器皿、废弃物等都必须先经过高压灭菌后再洗涤或倾倒。
(5)接种过程中，防止其他微生物进入培养基是获得纯培养物的关键环节。
①接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用。
②在接种过程中，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
③接种时要靠近酒精灯的火焰。
④尽量减少各种器皿敞口向上的时间和机会。
2．灭菌、消毒与防腐
处理方法 结果 应用实例
灭菌 强烈的物理、化学方法 杀灭物体表面以及内部的一切微生物 对器具和培养基进行高压蒸汽灭菌
消毒 较温和的物理、化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分不需要的微生物 消毒剂对皮肤、水果或饮用水进行消毒
防腐 根据微生物生长繁殖的特点，控制理化因素 抑制微生物生长繁殖 用除氧剂抑制需氧型微生物的繁殖；采用低温、盐腌、糖渍、干燥等防腐措施保存食物
3．微生物的实验室培养获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。下列无菌操作中，错误的是(　　)
A．对实验用的培养基，采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌
B．接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用
C．对操作者的双手、衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒
D．对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌
C　[对实验用的培养基，采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，A项正确；接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用，B项正确；对操作者的双手采用酒精进行消毒，C项错误；对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌，D项正确。]
4．为保证得到的培养物就是所需要的微生物，消灭器具和培养基中可能存留的各种类型微生物需要使用高压灭菌的方式，下列相关叙述错误的是(　　)
A．使用高压灭菌锅灭菌时所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的
B．在微生物实验中用121 ℃(1 kg/cm2压力)对实验器具和培养基进行15～20 min的灭菌处理是比较安全的
C．考虑到高压灭菌锅的使用效率，往往将培养基集中在一个较大的容器中放入高压灭菌锅灭菌
D．对含葡萄糖的培养基，采用适当升高温度、压力以及延长时间(30 min)的高压灭菌方法灭菌
D　[由于葡萄糖在115 ℃以上会焦化，故对含葡萄糖的培养基可采用适当降低温度、压力(112 ℃、500 g/cm2压力)以及延长时间(30 min)的高压灭菌方法灭菌。]
问题探究1通过对某种微生物培养基成分的分析培养学生的物质与能量观、适应观等生命观念，认识生物的多样性、独特性；问题探究2通过无菌操作培养学生实验操作、实施实验的科学探究能力。
1．(1)材料1中，该培养基含有微生物生长所需要的营养成分有哪几类？(生命观念)
提示：该培养基含有的营养成分有三类：水、无机盐和氮源。
(2)该培养基可培养什么样的微生物？说明理由。(生命观念)
提示：该培养基培养的是自养型微生物，因为该培养基中不含含碳有机物。
(3)若除去成分①，加入(CH2O)，该培养基可用于培养什么样的微生物？(科学探究)
提示：若除去成分①，加入含碳有机物可用于培养固氮菌。
2．在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无菌操作。材料2的图中符合无菌操作要求的有哪些？(科学探究)
提示：①②③⑤。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.发酵工程是采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接利用微生物的工作过程。2.培养基的成分中应包含微生物生长所需的水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。3.培养基的理化特性影响微生物的生长。不同的微生物代谢需求不同，只有满足目标微生物的代谢需求，才能使其快速生长。4.根据培养基的物理特征可以把培养基分成液体培养基和固体培养基等。根据培养基的化学成分可以把培养基分成合成培养基和天然培养基等。5.保证器具与培养基无菌是获得微生物“纯”培养物的基础。接种过程中，防止其他微生物进入培养基是获得纯培养物的关键环节。6.配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖斜面培养基操作提示：(1)注意控制好温度，防止培养基提前凝固。(2)不要让培养基粘在试管口。(3)试管中的液体量约为试管长度的1/4。试管加棉塞后，用牛皮纸包好。
1．不同培养基的具体配方不同，但一般都含(　　)
A．碳源、磷酸盐和维生素
B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐
D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
C　[培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还应考虑pH、特殊营养物质及O2等条件。]
2．下列有关培养基的说法，正确的是(　　)
A．液体培养基是指只加了水的培养基
B．固体培养基是指加热凝固了的培养基
C．分离某一特定的微生物时，应选用选择培养基
D．为了保证培养基成分不变，灭菌温度不能超过100 ℃
C　[配制成的液体状态的基质称为液体培养基，不含凝固剂成分，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，A错误；固体培养基是指在液体培养基中加入了凝固剂的培养基，B错误；分离某一特定的微生物时，应选用选择培养基，C正确；对培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min，D错误。]
3．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌(　　)
A．接种环、吸管、培养基、接种室
B．吸管、接种环、培养基、接种箱
C．培养基、吸管、接种环、接种箱
D．培养皿、吸管、培养基、双手
B　[干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下加热2～3 h，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min，主要用于培养基灭菌；紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。]
4．防止杂菌入侵并获得纯净的培养物是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(　　)
A．实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒
B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，防止被微生物感染
D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
B　[接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰部位灼烧灭菌，B错误。]
5．下表是某微生物培养基成分，请据此回答下列问题。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10 g
② (NH4)2SO4 0.4 g
③ K2HPO4 4.0 g
④ MgSO4 9.25 g
⑤ FeSO4 0.5 g
⑥ CaCl2 0.5 g
⑦ H2O 100 mL
(1)上表培养基可培养的微生物类型是________。
(2)若除去成分②，加入(CH2O)，该培养基可用于培养______。
(3)表中营养成分共有________类。
(4)不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是________________。
(5)若上表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是____________。
[解析]　(1)由题表可知，该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从外界环境中获取碳源的，因此培养的微生物是自养型微生物。
(2)该培养基若加入(CH2O)，培养基中就有了碳源，但除去成分②，培养基中就没有了氮源，该培养基就只能用于培养固氮微生物。
(3)题表中的营养物质有水、无机盐、无机氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。
(4)微生物生长需要一定的pH，所以培养基装瓶前需要调节pH。
(5)该培养基中无凝固剂，为液体培养基。菌种的纯化和鉴定通常利用固体平板培养基以获得单细胞菌落，因此需要加入凝固剂，如琼脂，将液体培养基转变成固体培养基。
[答案]　(1)自养型微生物　(2)固氮微生物　(3)三　(4)调节pH　(5)凝固剂第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
课标内容要求 核心素养对接
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.生命观念——通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。2.科学思维——根据微生物的代谢类型配制选择培养基；总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。3.科学探究——讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验方法并对实验结果进行评价。
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．接种
(1)定义：接种是指微生物进入培养基质的过程。
(2)类型：自然接种和人为接种。
2．单菌落
在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。
3．平板划线法
(1)连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面。(如图A)
(2)扇形划线是从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。(如图B)
A．连续平行划线　B．扇形划线
(3)多次连续平行划线接种时，划线可分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。(如图C)
(1)　　　　(2)　　　(3)　　　　(4)
C．多次连续平行划线
4．稀释涂布平板法
稀释涂布平板法(pour spread method)接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1 mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。
二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1．测定微生物数量的目的：了解目标微生物的繁殖速度_。
2．稀释涂布平板法
(1)问题：平板上的菌落即使是分开的，也可能难以数清其数量。如果菌落太多，准确数出菌落数并不容易，这会导致最终的计算结果出现较大误差。而菌液稀释度过大，菌落数少，虽然容易准确计数菌落数，但可能存在较大的随机误差。
(2)解决方法：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。
3．显微镜计数法
(1)血细胞计数板
①侧面观
1．血细胞计数板　2.盖玻片　3.中央平台　4.凹槽
②中央平台上、下两个部分各刻有一个计数区。
③计数区由长、宽各1 mm的9个大方格组成。
④大方格
a．每个大方格内的液体体积：0.1_mm3。
b．分类：红细胞计数区和白细胞计数区。
c．红细胞计数区又用双线分成25(或16)个中方格，每个中方格再用单线划分为16(或25)个小方格。
(2)用显微镜进行酵母细胞计数
①步骤：先将专用的盖玻片盖在计数板上，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加摇匀的酵母菌悬液，让菌液渗入盖玻片下直至充满计数区。
②注意事项：滴加菌液时，一方面要避免菌液滴到盖玻片上，另一方面要注意防止产生气泡，以免影响计数结果。
③计数区域：红细胞计数区。
④取样原则：随机取样。
⑤对有25个中方格的红细胞计数区取样方法：“五点取样”。
⑥在计数每一小方格中的细胞数时，应只计数每一小方格上方和左侧线条上的细胞数(即“数上不数下”“数左不数右”)。
⑦每毫升菌液中的酵母细胞数：酵母细胞个数/mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10_000×稀释倍数。
三、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1．不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。
2．许多微生物的代谢方式并不唯一。
(1)某些异养型微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质。
(2)自养型微生物也并非不能利用有机物生长。
(3)营养方式的可变性提高了微生物在环境中的生存能力。
3．培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。
4．选择培养基
(1)概念：在培养基中添加(或减去)某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
(2)用途
①从混杂的微生物群体中快速筛选出所需种类的目标微生物。
②从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。 (√)
2．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。
(×)
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。
3．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)
提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
4．借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。 (√)
5．异养微生物只能以有机物为碳源，自养微生物也可以利用有机物生长。 (×)
提示：某些异养微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质，它们只是不以CO2为唯一碳源。
6．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。 (×)
提示：尿素分解菌将尿素转化为氨，使培养基的pH升高。
　采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
2.接种、培养并分离酵母菌
(1)目的要求
①用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
②用液体培养基大量扩增酵母菌。
(2)方法步骤
制作平板→接种(用平板划线法接种、用稀释涂布平板法接种，将菌种接种到液体培养基中)→培养→观察培养结果→挑取菌落利用划线法接种至试管斜面培养基中。
(3)注意事项
①在用接种环蘸取菌液进行接种前，应在酒精灯火焰上从接种环的圆环处依次向上灼烧灭菌。
②为避免灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴在培养容器内壁上降温。
③初次划线时可参照培养皿底面的标记点进行划线，以保证有最好的划线分离效果。
④在使用蘸有酒精的涂布器对平板中的菌液进行涂布时，应先在火焰上使酒精燃烧尽。此时手持涂布器的部位应高于火焰上的部位，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。
⑤涂布和划线均应在酒精灯旁进行。
⑥用接种环在无菌条件下将菌液接种到液体培养基中，同时以不接种菌液的液体培养基作为对照。
1．在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示，且甲、乙的对应位置不变。有关叙述错误的是(　　)
甲　　　　乙
A．配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B．甲中a区域为划线的起始位置
C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D．图示接种过程中接种环灼烧了5次
B　[为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行高压蒸汽灭菌，A正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落，C正确；由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，接种过程中接种环灼烧了5次，D正确。]
2．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是(　　)
A．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌往往会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用菌落密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
C　[稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，值得注意的是，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，A、B正确。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数；设计实验时，一定要至少用三个平板做重复实验，才能增强实验的说服力和准确性。分析结果时，一定要考虑所设置的重复实验的结果是否一致，差别不大时，取平均值作为统计结果，C错误，D正确。]
　微生物的数量测定和选择培养
1．微生物的计数
常用的微生物的计数方法有直接计数法和间接计数法。二者比较如下：
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂，且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×10 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝×稀释倍数
2.特定培养基的设计原理与应用实例
特定培养基的设计原理 应用实例
具体处理 分离菌种
依据营养需求 不添加碳源 自养微生物(硝化细菌等)
不添加氮源 固氮微生物(圆褐固氮菌等)
以尿素为唯一氮源 能分解尿素的微生物
以石油为唯一碳源 能分解石油的微生物
加入某种化学物质，其不作为营养物质，对目标微生物无害，但会抑制或杀死其他微生物 加入青霉素、四环素或链霉素 抑制细菌和放线菌生长→分离酵母菌、霉菌等
加入10%的酚 抑制细菌和霉菌生长→分离放线菌
利用特殊环境 置于无氧条件下 厌氧型和兼性厌氧型微生物→分离乳酸菌、酵母菌等
置于高盐环境中 其他菌在高盐环境中易失水而不能生存→分离金黄色葡萄球菌
置于高温环境中 其他微生物因酶失活而无法生存→分离耐高温微生物
1．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
2．稀释涂布平板法和显微镜计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微镜计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
3．(2021·四川绵阳期末)某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是(　　)
A．可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L
B．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C．一般选择菌落数为30～300的平板进行计数
D．显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数
D　[将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1 000×100＝5.7×107个/L，A正确；由于两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；显微镜计数法统计的是稀释液中所有菌体的数目，包括活菌和死菌，D错误。]
4．(2020·济南外国语学校高二月考)某种菌在30 ℃的环境下，经过6周后会产生2种不同的酶，几乎可将PET塑料完全分解。下图是分离、纯化和保存菌株的过程，相关叙述正确的是(　　)
A．塑料垃圾中含有大量微生物，是分离该菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落
C．通过涂布平板法可以获得单菌落
D．斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株
B　[塑料垃圾中含有大量微生物，但不一定含有分解PET塑料的菌株，A项错误；筛选培养基中需要加入PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落，从而获得分解PET塑料的菌株，B项正确；在涂布平板上长出的菌落，可以通过划线或稀释涂布平板法进一步纯化得到单个菌落，C项错误；斜面培养基中含有大量营养物质，可在低温下临时保存菌株，如果长期保存菌株应选择甘油管藏法，D项错误。]
　能分解尿素的微生物的分离与计数
1．实验原理
(1)分离原理
当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶(urease)的微生物才能在该培养基中生长。因为它们可以通过脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的氮源。利用这种培养基就分离出土壤中能产生脲酶的微生物。
(2)鉴定原理
因为微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
2．目的要求
(1)利用选择培养基分离能产生脲酶的微生物。
(2)观察微生物代谢改变环境pH的现象。
(3)利用稀释涂布平板法对微生物进行计数。
3．方法步骤
制备培养基
↓　
灭菌：在121 ℃下灭菌15 min后待用
↓　
倒平板
↓　
制备土壤细菌悬液：梯度稀释
5．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的LB培养基作为对照
C．该实验应采用稀释涂布平板法
D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B　[利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的LB培养基上培养作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
6．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
(1)若取土样6 g，应加入________mL的无菌水配制成稀释10的倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为_______________。将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中________倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为________个。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目________(填“低”或“高”)。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数/个 1号平板 478 367 277 26 5
2号平板 496 354 261 20 8
3号平板 509 332 254 29 3
(2)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________
________________________________________________________________。
将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
[解析]　(1)根据题意分析，需要稀释10倍的土壤溶液，因此应该将6 g土样加入54 mL的无菌水进行配制；将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上；估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30到300之间的平板，分析表格中数据可知，稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围；每克土壤中的菌落数为(277＋261＋254)÷3×105÷0.2÷6＝2.2×107个。稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于菌落之间会相互重叠，因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度＝45×5÷0.1÷10－3×102＝2.25×108个/mL。
[答案]　(1)54　稀释涂布平板法　105　2.2×107　低　(2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落　2.25×108
微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。如图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。
通过本案例培养学生的演绎与推理和对实验结果的交流与讨论能力。
(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是什么？(科学思维)
提示：将微生物分散成单个细胞，进而获得单个菌落。
(2)根据D的染色结果，判断B平板中产油脂芽孢杆菌的菌落是哪一个？(科学思维)
提示：3。
(3)采用什么方法将B平板中的产油脂芽孢杆菌的单菌落进一步纯化培养得到E？(科学思维)
提示：平板划线法或稀释涂布平板法。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。2.平板划线法接种时，通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后，在固体培养基表面进行连续平行划线、扇形划线或其他形式的划线，以实现接种的目的。3.稀释涂布平板法接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1 mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。4.利用稀释涂布平板法计数微生物数量：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。5.利用显微镜进行酵母细胞计数：每毫升菌液中的酵母细胞数＝80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数。6.在培养基中添加(或减去)某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A　[在A项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌，而B项中无尿素作氮源，C项中缺少碳源，D项中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(　　)
A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B．统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C．筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
A　[统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。]
3．(2020·太原实验中学高二月考)判断选择培养基是否起到了选择作用时，需要设置的对照是(　　)
A．未接种的选择培养基
B．接种了的LB培养基
C．未接种的LB培养基
D．接种了的选择培养基
B　[选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组，需要用接种了的LB培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．(2020·陕西延安吴起高中高二期末)下图表示培养和分离酵母菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是(　　)
①　　　　　　②　　　　　③
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
C．步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注
C　[图中①是倒平板，②是进行平板划线，③是培养。对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A项错误；倒完平板后立即盖上培养皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C项正确；图中操作结束后需在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在培养皿盖上做标注，D项错误。]
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是__________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是_______________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的(含培养基的)培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案]　(1)脲酶　(2)无机盐　只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长　(3)形状、大小　4.2×108　稀释涂布平板法　(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的(含培养基的)培养皿进行培养第三节　发酵工程为人类提供多样的生物产品
第1课时　传统发酵技术的应用
课标内容要求 核心素养对接
举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。 1.生命观念——运用结构功能观认识乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的结构特点和代谢特点。2.科学探究——运用发酵原理，设计并完成利用天然菌种制作泡菜、果酒和果醋的实验探究并对实验结果进行分析和评价。3.社会责任——关注食品安全和健康的生活方式。
一、某些食品、饮料及调味品是运用传统发酵技术生产的
1．最早制成的发酵饮料大概要算在游牧社会出现的奶酒。我国是酱油生产最早的国家。
酿制常见的发酵食品、饮料和调味品的原料及菌种
发酵产品 菌种 原料
面包 酿酒酵母 小麦面粉
糯米酒 酵母菌、霉菌、乳酸菌 糯米
酸奶 乳酸菌 牛奶、羊奶
葡萄酒 酵母菌、纤细杆菌 葡萄
黄酒 青霉、毛霉、根霉、酵母菌 糯米、黍米、粳米
啤酒 酿酒酵母 大麦、酒花
酱油 曲霉、酵母菌、乳酸菌 小麦、蚕豆、薯、米
食醋 醋酸菌、曲霉、酵母菌 米、麦、薯等
豆腐乳 曲霉、毛霉、根霉 大豆、冷榨豆粕
泡菜 乳酸菌、明串珠菌 蔬菜、瓜果
奶酪 乳杆菌、乳球菌 鲜牛奶
味精 谷氨酸棒杆菌 糖蜜、淀粉、葡萄糖和玉米浆
β 胡萝卜素 三孢布拉氏霉 淀粉、豆粉、无机盐
(1)许多传统发酵食品使用的菌种中都包含酵母菌和乳酸菌。
(2)酵母菌或乳酸菌只是习惯上的归类，并不完全代表当今微生物分类学上的名称。
①酵母菌只是对进行出芽生殖或裂殖的真核、单细胞微生物的统称，已知的酵母菌至少有56属，约500多种。
②乳酸菌则是对能够发酵糖类产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的统称，已知的乳酸菌约有430多种。
2．发酵食品的不同风味由多种因素造成
(1)不同的微生物、不同的菌株能够分泌的酶种类不同，分解大分子有机物后形成的产物也就不同。
(2)菌株遗传上的差异会造成发酵产品的风味不同。
(3)混菌发酵也影响发酵食品的风味。
传统发酵菌种中微生物的种类、代谢特点、种间关系等都是造成不同发酵制品的风味和营养物质有差异的原因。
二、体验传统发酵
1．利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋
(1)实验原理
一些果实的表面附有许多微生物，如葡萄果实的表面就常常附有肉眼看不见的酵母菌。放置过久的葡萄有时会自然散发出酒味，就是酵母菌发酵的结果。酵母菌在无氧条件下，通过厌氧呼吸，将葡萄糖氧化为乙醇和二氧化碳。有时放置过久的葡萄也会发出酸味或其他味道，这是其他微生物活动的结果。例如，醋酸菌在有氧条件下可将乙醇氧化为醋酸。
(2)方法步骤
选取酒味较重的一瓶，用小刀在发酵液面以上的瓶壁戳一小洞，放置在温暖的环境中。24 h后打开瓶盖就会闻到果酒在有氧条件下发酵产生的果醋的气味
2．利用乳酸菌发酵制作泡菜
(1)实验原理
泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等发酵制成的。这些微生物一般为厌氧、兼性厌氧或微好氧菌。它们的发酵产物不仅有乳酸，还会有醇、酯等，因而使泡菜具有特殊的风味。
(2)方法步骤
处理材料
↓
腌制泡菜
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．菌株是指来自一种微生物的每一个来源不同的纯培养物。 (√)
2．菌种中不同的微生物之间只存在互利的关系。 (×)
提示：菌种中不同的微生物可能互利，可能竞争，也可能存在一种排斥其他若干种微生物生长的现象。
3．同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动，所形成的代谢产物都是相同的。 (×)
提示：不同微生物或同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动，所形成的代谢产物不同，制成的发酵食品的风味也就不同。
4．将葡萄用清水洗净、晾干后，挤碎并连皮一同放入矿泉水瓶中，放入的葡萄体积不能超过矿泉水瓶体积的2/3。 (×)
提示：所放入的葡萄体积不要超过矿泉水瓶体积的1/2。
5．对于新配制的泡菜原料，如果加入一些老泡菜汁，可以缩短腌制时间，这是因为老泡菜汁中有较多的发酵菌。 (√)
　某些食品、饮料及调味品是运用传统发酵技术生产的
1．发酵食品中的微生物种类多样。发酵酿制糯米酒和酱油的菌种都是霉菌、酵母菌和乳酸菌，但糯米酒和酱油的风味差别很大。要解释产生这一现象的原因，需要了解一些微生物分类、代谢的知识。
2．许多传统发酵食品使用的菌种中都包含酵母菌和乳酸菌。其实酵母菌或乳酸菌只是习惯上的归类，并不完全代表当今微生物分类学上的名称。
3．传统发酵菌种中的微生物在分类上具有多样性，如：两种国产食醋发酵菌种中的微生物种类。
产品名称 发酵微生物
镇江香醋 乳酸菌(Lactobacillus)
醋酸菌(Acetobacter)
葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)
葡萄球菌(Staphylococcus)
肠杆菌(Enterobacter)
酵母菌属(Saccharomyces)
德克酵母属(Dekkera sp.)
山西老陈醋 酒香酵母属(Brettanomyces sp.)
卵孢酵母属(Oosporium sp.)
克鲁弗氏酵母属(Kluveromyces sp.)
毕赤酵母属(Pichia sp.)
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)
4.不同微生物或同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动，所形成的代谢产物不同，制成的发酵食品的风味也就不同，如图表示酱油发酵的大致过程及菌种发酵的风味产物。
5．传统发酵所使用的菌种是人们在世世代代的生产生活中不断筛选保留下来的、在自然界中自然存在的“杂居混生”的微生物群落。群落中的不同微生物相互作用可导致发酵制品风味的不同。菌种中不同的微生物可能互利，可能竞争，也可能存在一种排斥其他若干种微生物生长的现象。
1．生活中的一些食品、饮料及调味品是经过微生物发酵后制成的。下列相关叙述错误的是(　　)
A．在游牧社会出现的奶酒是最早制成的发酵饮料
B．传统发酵食品使用的酵母菌只是对进行出芽生殖或裂殖的真核、单细胞微生物的统称
C．大多数微生物以现成的有机物为食，通过胞内酶将其分解成小分子物质后，再合成自身物质
D．在糯米酒发酵中乳酸菌产生的乳酸与酵母菌发酵产生的酒精发生反应生成酯类
C　[大多数微生物需要以现成的有机物为食，不过由于它们的结构简单，因此多以分泌胞外酶的方式消化、分解大分子有机物后，再吸收所需的小分子物质。]
2．传统发酵所使用的菌种是人们在世世代代的生产生活中不断筛选保留下来的、在自然界中自然存在的“杂居混生”的微生物群落。下列说法错误的是(　　)
A．传统酿造酱油所使用的菌种有曲霉、酵母菌、乳酸菌等
B．酸奶发酵过程中，保加利亚乳杆菌代谢产生的甲酸和二氧化碳可促进嗜热链球菌的生长
C．在酱油发酵菌种中的嗜盐片球菌在盐水发酵前期产生的乳酸，在形成特殊风味的同时也抑制其他存在竞争关系的杂菌的生长
D．乳酸菌代谢产生的乙醛和双乙酰，与糯米酒特殊的风味有关
B　[酸奶发酵过程中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的特定菌株之间就存在互利的关系。保加利亚乳杆菌代谢产生的小肽和氨基酸可促进嗜热链球菌的生长，而嗜热链球菌代谢产生的甲酸和二氧化碳可刺激保加利亚乳杆菌的生长。]
　体验传统发酵
1．利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋
(1)果酒与果醋制作的比较
果酒制作 果醋制作
发酵菌种 来源 附着在葡萄皮上的野生型酵母菌 空气中的醋酸菌
分类地位 单细胞真核生物 单细胞原核生物
繁殖方式 出芽生殖、孢子生殖 二分裂生殖
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型
联系 醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行，酒精发酵为醋酸发酵提供原料
(2)发酵过程中酵母菌数量、酒精含量及pH变化分析
①果酒发酵过程中酵母菌数量和酒精含量的变化
a．菌体数量的变化：发酵初期，酵母菌进行需氧呼吸，大量繁殖。发酵中期形成无氧环境，酵母菌数量增加缓慢，最后达到稳定。发酵后期由于酒精含量较高，可能会导致酵母菌大量死亡。
b．酒精含量的变化：发酵初期，酵母菌进行需氧呼吸，酒精含量很低。发酵中期，酵母菌进行厌氧呼吸产生大量酒精，酒精含量增加。发酵后期，由于酒精含量升高，大量酵母菌死亡，酒精含量不再增加。
②果酒、果醋制作过程中pH的变化
a．果酒发酵时产生的部分CO2会溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。
b．果醋发酵时产生的醋酸溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。
(3)注意事项
①所放入的葡萄体积不要超过矿泉水瓶体积的1/2。为提高酒精产量，可在两个矿泉水瓶中适当添加白糖。
②矿泉水瓶中不可加水；不可用不能自动排气的玻璃瓶作为发酵的容器，以免发酵产生的大量气体使瓶子炸裂，造成危险。
2．利用乳酸菌发酵制作泡菜
(1)与泡菜制作有关的菌类——乳酸菌
生物学分类 原核生物
常见类型 明串珠菌、乳酸菌
分布 广泛分布于空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内
代谢类型 异养厌氧型
生产应用 制作酸菜、酸奶等
发酵原理 C6H12O6―→2C3H6O3
(1)乳酸菌是对能够发酵糖类产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的总称。
(2)乳酸菌是厌氧型微生物，在有氧气存在时，厌氧呼吸受抑制。
(3)抗生素能杀死乳酸菌或抑制乳酸菌的生长，所以含抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。
(2)制作泡菜的注意事项
①用于制作泡菜的蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的亚硝酸盐含量相对较高。
②按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水。盐的用量过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；用量过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。盐水要煮沸后冷却。煮沸的作用：一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
③控制严格的厌氧条件
a．选择合理的发酵容器，如泡菜坛，这是一种既科学又简单的厌氧容器。
b．盐水煮沸后冷却待用。
c．装坛时压实，盐水没过全部菜料。
d．泡菜坛用水封口，不让空气进入，创造一个封闭无氧的环境，发酵期间不宜开盖，并注意在发酵过程中经常向水槽中补充水。
④控制适宜的发酵温度
温度过高易致杂菌滋生；温度过低不利于乳酸发酵，会使发酵时间延长。
⑤控制发酵时间
一般在腌制7天后，亚硝酸盐含量开始下降。但泡菜发酵时间并不是越长越好，一方面发酵时间过长，可能会产生其他有害物质，另一方面，发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。
1．在果酒和果醋制作中，你认为哪些方法可防止发酵液被污染？
提示：(1)冲洗葡萄时应先冲洗再除去枝梗。(2)榨汁机要冲洗干净并晾干。(3)发酵瓶要清洗干净，并用70%的酒精消毒。(4)给矿泉水瓶安装可折弯吸管。
2．果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？
提示：发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。
3．制作泡菜时，营造“无氧环境”的措施有哪些？
提示：(1)选择的泡菜坛要密封性好；(2)加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料；(3)盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
3．(2021·潍坊模拟)“每天喝一点，健康多一点”是某品牌枸杞果酒提出的消费理念。下列为生产该枸杞果酒的传统工艺流程，有关分析错误的是(　　)
选料→？→粉碎→灭菌→接种→发酵→？→果酒
A．流程中两处“？”依次表示冲洗和过滤
B．制作枸杞果酒时，温度应该控制在18～30 ℃
C．在酒精发酵旺盛时，若因前期灭菌不合格导致容器中存有醋酸菌，则醋酸菌可将果汁中的糖分解为醋酸
D．可在酸性条件下用重铬酸钾溶液来检验是否有酒精产生
C　[流程中两处“？”依次表示清水冲洗和过滤，过滤的目的是除去果皮等杂质，A正确；由果酒制作的原理可知，制作枸杞果酒时，温度应该控制在18～30 ℃，B正确；在酒精发酵旺盛时，若因前期灭菌不合格导致容器中存有醋酸菌，由于此时为缺氧环境，而醋酸菌为需氧型微生物，在无氧条件下无法生存，因此，醋酸菌不能将果汁中的糖分解为醋酸，C错误；酒精在酸性条件下与重铬酸钾溶液发生颜色反应，由橙色变为灰绿色，以此原理可以来检验是否有酒精产生，D正确。]
4．回答下列有关泡菜制作的问题。
(1)制作泡菜时，所用盐水要煮沸，其目的是_______________________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的目的是______________。
(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵过程即乳酸菌进行________________的过程。该过程发生在乳酸菌的________________中。
(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有__________、________和________等。
(4)从开始制作到泡菜质量最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸，这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是_________________________________
_____________，原因是____________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)制作泡菜时需要先形成无菌环境，所用盐水需煮沸，以杀灭盐水中的微生物并除去水中氧气。想要缩短制作时间，应该缩短菌株的生长时间，陈泡菜液中含有一定量的乳酸菌，加入陈泡菜液可以使菌体数量扩增速度加快。(2)乳酸菌为厌氧菌，进行厌氧呼吸产生乳酸，该过程只能在细胞质基质中进行。(3)温度过高、腌制时间过短、食盐用量不足等，容易造成杂菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。(4)从开始制作到泡菜质量最佳这段时间内，氧气浓度逐渐降低，泡菜液逐渐变酸，不适宜杂菌生长，而适宜乳酸菌生长，因此乳酸菌数量增多，其他杂菌数量减少。
[答案]　(1)杀灭盐水中的微生物并除去水中氧气　增加乳酸菌的数量　(2) 厌氧呼吸　细胞质基质　(3)温度　腌制时间　食盐用量　(4)乳酸菌数量增多，其他杂菌数量减少　乳酸菌比杂菌更耐酸
发酵过程中控制杂菌的方法
(1)泡菜坛的密闭性及灭菌。
(2)蔬菜的清洗可以防止杂菌繁殖。
(3)食盐的用量合适可以控制杂菌的繁殖。
(4)调味料也具有抑菌的作用。
(5)泡菜盐水的浸泡提供的无氧环境为乳酸菌的繁殖提供条件，同时又能抑制好氧菌繁殖。
为获得优良的发酵食品，某实验室在三支试管中培养了酵母菌、醋酸菌、乳酸菌，实验结果如图。
甲　 　乙　　　丙
通过本探究案例能够提高学生对生物学问题进行观察、思考、分析的能力及对实验现象和结果进行交流和讨论的能力。在探究过程中，可增强学生的好奇心和求知欲。
试问甲、乙、丙三支试管中分别培养的是什么菌种？并说明判断的理由。(科学思维)
提示：甲试管中培养的是醋酸菌，乙试管中培养的是乳酸菌，丙试管中培养的是酵母菌。因为醋酸菌是需氧型的，因此生长在试管的上层；乳酸菌是厌氧型的，因此生长在试管的下层；酵母菌是兼性厌氧型的，因此在试管的上下层都有生长。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.传统发酵食品使用的菌种中酵母菌只是对进行出芽生殖或裂殖的真核、单细胞微生物的统称，已知的酵母菌至少有56属，约500多种。乳酸菌则是对能够发酵糖类产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的统称，已知的乳酸菌约有430多种。2.不同微生物或同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动，所形成的代谢产物不同，制成的发酵食品的风味也就不同。3.菌株是指来自一种微生物的每一个来源不同的纯培养物。菌株遗传上的差异会造成发酵产品的风味不同。4.群落中的不同微生物相互作用可导致发酵制品风味的不同。菌种中不同的微生物可能互利，可能竞争，也可能存在一种排斥其他若干种微生物生长的现象。
1．人们还在各自的生产生活实践中，逐步摸索总结出了在自然接种和混菌培养条件下，利用有益微生物来酿造自己喜爱的风味食品、饮料和调味品的技术。下列相关叙述错误的是(　　)
A．发酵酿制糯米酒和酱油的菌种都是霉菌、酵母菌和乳酸菌，它们都是真核生物
B．大多数微生物结构简单，需要以现成的有机物为食
C．菌株遗传上的差异会造成发酵产品的风味不同
D．传统发酵所使用的菌种是人们在世世代代的生产生活中不断筛选保留下来的、在自然界中自然存在的“杂居混生”的微生物群落。
A　[乳酸菌是对能够发酵糖类产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的统称。]
2．下列关于用塑料瓶制作果酒和果醋的叙述，正确的是(　　)
A．为了提高果酒的产出量，果汁应尽量装满发酵瓶
B．醋酸发酵阶段应封闭瓶口，防止杂菌污染
C．制作果酒装置时，需安装可折弯吸管
D．果酒制成后，可将装置转移至温度较高的环境中制作果醋
D　[葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/2的空间，这样既有利于酵母菌有氧呼吸，大量繁殖，又可防止果酒发酵时产生大量二氧化碳使果汁溢出。醋酸发酵是需氧发酵，应通入氧气，发酵时应敞开瓶口并在瓶口盖上纱布以防杂菌污染。制作果酒装置时安装可折弯吸管，既可排出气体又可避免杂菌污染。醋酸菌发酵的适宜温度比酵母菌高。]
3．(2021·浙江名校联盟月考)下列关于泡菜发酵过程的叙述，正确的是(　　)
A．发酵时间越长，亚硝酸盐的含量越高
B．发酵过程中只有乳酸菌一种微生物发挥作用
C．发酵过程中乳酸菌可以分解蛋白质和果胶
D．发酵过程中要经常补充水槽中的水
D　[随着发酵的进行，亚硝酸盐含量先逐渐增加，后又逐渐降低，A项错误；泡菜发酵过程中，发挥主要作用的是乳酸菌，此外酵母菌也发挥了作用，B项错误；发酵过程中乳酸菌不分解蛋白质和果胶，因而能使蔬菜脆嫩而不软化，C项错误；经常补充水槽中的水，目的是保持坛内的无氧状态，D项正确。]
4．某研究性学习小组以樱桃、番茄为材料进行果酒、果醋的发酵实验。下列相关叙述正确的是(　　)
A．酵母菌是好氧细菌，所以果酒发酵所需的最适温度较高
B．先供氧进行果醋发酵，然后隔绝空气进行果酒发酵
C．与人工接种的发酵相比，自然发酵获得的产品品质更好
D．适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖
D　[醋酸菌是好氧细菌，果醋发酵所需的最适温度较高，果酒发酵所需的温度是18～30 ℃，而醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃，A项错误；进行果酒、果醋发酵实验，要先隔绝空气进行果酒发酵，然后接种醋酸菌，通入空气，进行果醋发酵，因为醋酸菌可以将酒精转变为醋酸，B项错误；与人工接种的发酵相比，自然发酵过程中菌种量比较少，且菌种本身品质不好，因此，自然发酵获得的产品品质较差，而人工接种菌种的品质更好，且不容易存在杂菌污染，C项错误；适当加大接种量，让菌体快速形成优势菌群，可以抑制杂菌生长，提高发酵速率，D项正确。]
5．从古至今人们广泛利用微生物发酵进行食品加工，如酿酒、制醋等。请回答下列相关问题。
(1)传统发酵技术经常采用野生菌种，在家庭中以葡萄为原料制作葡萄酒时，可以不添加菌种，原因是________________________
_________________，但现代发酵工业常采用纯化的优良菌种，这样可以____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)酿酒时，温度应该控制在________。某同学在通过发酵制作果酒时，发现在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
在制作葡萄酒的过程中，如果密封不严混入空气，发酵液会变酸，可能的原因是_________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
反应简式是__________________________________________。
(3)在果酒制作中，加入的新鲜葡萄汁没有经过灭菌处理，但是在制出的果酒中基本检测不出酵母菌以外的杂菌，从生态学角度分析：一是酵母菌与杂菌之间存在________________关系；二是由于果酒中的________不利于杂菌的生长。
[解析]　(1)在家庭中以葡萄为原料制作葡萄酒时，不添加酵母菌，原因是在葡萄皮表面附着有大量的野生酵母菌；现代工业发酵用纯化的优良菌种进行发酵，可以避免杂菌污染，保证产品的质量。(2)酒精发酵时一般将温度控制在18～30 ℃。制作果酒时，在原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是酵母菌可以利用糖进行厌氧呼吸产生酒精；在制作葡萄酒的过程中，如果密封不严混入空气，发酵液会变酸，可能的原因是醋酸菌发酵产生醋酸。在书写反应式时，反应物是C2H5OH和O2，生成物是CH3COOH和水，还有能量，箭头上注明酶。(3)加入的新鲜葡萄汁没有进行灭菌处理，但是在制出的果酒中基本检测不出酵母菌以外的杂菌，从生态学角度分析：一是酵母菌在与杂菌之间的竞争中取得优势，二是果酒中的酒精不利于杂菌生长，从而淘汰掉杂菌。
[答案]　(1)葡萄皮表面附着有大量的野生酵母菌　避免杂菌污染，保证产品的质量　(2)18～30 ℃　酵母菌可以利用糖进行厌氧呼吸产生酒精　醋酸菌发酵产生醋酸　C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量　(3)竞争　酒精第2课时　发酵工程及其应用
课标内容要求 核心素养对接
1.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。2.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。 1.科学思维——基于发酵工程的基本环节和应用实例，阐明发酵工程的概念。2.科学探究——根据发酵产品和利用微生物的不同讨论发酵工程中的发酵条件及控制方法。3.社会责任——认可发酵工程在生产上重要的应用价值。
一、发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品
1．微生物发酵是一个复杂的过程。鉴于菌种特性、原料和产物的特点、技术设备的可行性以及成本核算等诸多因素，现代发酵工业大多是采用好氧、液体、深层、分批及单一纯种发酵的方式组合进行的。其中好氧以及用单一纯种微生物生产单一产品是现代发酵工业的主流。
2．微生物工业发酵的基本过程
(1)选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。
(2)将菌种扩大培养才能满足大规模生产的需要。
(3)对发酵过程进行控制才能获得所需要的产品。
(4)控制发酵过程是保证发酵生产高效顺利进行的重要措施。
(5)菌种在不同的发酵阶段要求的环境条件是不同的。
(6)分离或提纯发酵产品是工业发酵制取产品必经的步骤。
(7)分离后的生物产品还需要进一步提纯，经过质检合格后才能成为产品。
二、发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
1．发酵工程特点：生产条件温和、原料丰富且价格低廉、废弃物对环境影响小且容易处理。
2．微生物发酵的食品和饮料在生活中比比皆是，高居微生物工业的榜首。
3．绝大多数抗生素也是微生物发酵的产物，或由微生物发酵产物加工而成。
4．近年来，在医药领域开发的酶抑制剂、免疫调节剂、类激素、抗氧化剂、生物表面活性剂和抗辐射药物等许多新药也是微生物发酵的产物或衍生物。
5．酶制剂是发酵工程对工业化生产的又一贡献
(1)采用发酵工程生产的酶制剂除了应用于食品工业生产中，还广泛应用于洗涤剂生产、纺织、皮革、造纸工业中。
(2)许多在极端条件下仍具有功能的酶来自极端环境中的微生物，这些酶通过发酵工程生产，已经在许多高温、高盐、强酸、强碱条件下的工业生产过程中发挥作用。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．发酵工程利用的菌种都是从自然界中筛选出来的。 (×)
提示：发酵工程的菌种也可以通过诱变育种和基因工程育种获得。
2．好氧、用单一纯种微生物生产单一产品是现代发酵工业的主流。 (√)
3．发酵工程中要对培养基进行灭菌，发酵设备不用灭菌。 (×)
提示：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
4．对菌种扩大培养是发酵工业的前提条件。 (×)
提示：选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。将菌种扩大培养可满足大规模生产的需要。
5．发酵工程具有生产条件温和、原料丰富且价格低廉、废弃物对环境影响小且容易处理的特点。 (√)
　发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品
1．选育高产、优质的菌种
(1)需满足的条件
①应选择高产的菌种，使菌种的发酵产物中，需要的产物多，不需要的产物少。
②培养基来源充足且廉价，被转化的效率高。
③菌种发酵产物易于分离。
④菌种对环境没有明显或潜在的危害。
⑤菌种的遗传特性和生产能力稳定。
(2)得到符合要求的菌种措施
①筛选并不断地选育或改良菌种，以保持菌种健壮旺盛的生命力。
②减少菌种的传代次数能减小菌种发生自发突变的概率。
③对于已出现衰退迹象的菌种要进行分离筛选，保留高产的菌株，用于大规模的发酵工业生产。
2．扩大培养
(1)在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养。
(2)目的：增加菌种数量，缩短菌种在发酵罐中发酵的时间。
3．控制发酵过程
(1)发酵罐的大小取决于生产需要。
(2)在密封的罐体上安装各种阀门、管道、传感器、仪表等，以监控发酵过程的营养供给、氧气、温度、pH等变化。
(3)发酵控制
发酵原料
↓　
预处理
↓　
发酵培养基的配制(添加水、无机盐、其他营养物，调碳氮比、pH等)
↓　
灭菌
↓接种
大型发酵(测量和控制发酵温度、pH、溶解氧等)
4．分离或提纯发酵产品
(1)发酵产品是菌体本身：采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来。
(2)发酵产品是微生物的代谢产物：采用真空发酵、吸附发酵、萃取发酵等方法进行提取。
(3)分离后的生物产品还需要进一步提纯，经过质检合格后才能成为产品。
1．现代发酵工程和传统发酵技术所用菌种的来源有什么差异？
提示：传统发酵技术用的菌种一般是原材料中天然存在的多种菌种，而现代发酵工程用的菌种是通过微生物培养技术获得的单一菌种。
2．与化工生产相比，为什么发酵工程的生产条件比较温和？
提示：发酵是利用微生物的代谢将原料进行转化，而微生物细胞代谢是在常温常压条件下进行的，因此发酵工程的生产条件比较温和。
1．发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。下列关于发酵工程的认识错误的是(　　)
A．发酵工程具有条件温和、产物单一、污染小的特点
B．发酵工程的产品包括微生物的代谢产物和菌体本身
C．通常所指的发酵条件包括温度、溶解氧和pH等
D．发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵
D　[传统发酵技术和发酵工程都是利用各种微生物的代谢来实现相关产品的生产的，D错误。]
2．下列关于发酵工程的说法，错误的是(　　)
A．在菌种选育过程中，可以利用人工诱变或基因工程等手段
B．虽然青霉素是抗生素，但在青霉素生产过程中仍然需要严格灭菌
C．发酵时，发酵条件变化会影响微生物生长，不影响微生物的代谢途径
D．发酵工程的产品可以采用过滤、沉淀、蒸馏、萃取等方法提取
C　[环境不同，同种微生物的代谢产物可能不同。发酵时，pH、氧气、温度等发酵条件变化不仅会影响微生物生长，也会影响微生物的发酵产物。]
　发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
1．发酵工程的特点：生产条件温和、原料丰富且价格低廉、废弃物对环境影响小且容易处理。
2．发酵工程的应用：在食品工业、医药工业、冶金工业、农业、环境保护等许多领域得到了广泛的应用，为社会提供了众多的微生物发酵产品。
3．发酵工程与传统发酵技术的比较
发酵工程 传统发酵技术
不同点 菌种 通过微生物纯培养技术筛选或其他技术生产的优良菌种，大多是单一菌种 原材料中天然存在的混合菌种
发酵方式 以液体发酵为主 以固体发酵或半固体发酵为主
对发酵条件的控制 严格无菌操作，防止杂菌污染。通过现代工程技术对发酵条件精确地控制，使发酵条件处于最佳状态 不是无菌操作，容易受到杂菌污染。对发酵条件不能严格控制，易受外界条件影响
生产规模和产品 生产规模大，实现了工业化生产。原料来源丰富，成本低，产物多样，产量高 通常是家庭式或作坊式的，产量低，生产往往受季节和原料限制，产品风味品种比较单一，质量不稳定
相同点 ①都是利用了微生物的作用②发酵工程是在传统发酵技术的基础上发展起来的
3．近年来，在医药领域开发的许多新药也是微生物发酵的产物或衍生物，下列有关叙述错误的是(　　)
A．近年来，发酵工程在医药领域开发的新药有酶抑制剂、免疫调节剂、类激素、抗氧化剂、生物表面活性剂和抗辐射药物等
B．普伐他丁是一种类激素，临床上能显著降低患者血液中胆固醇的浓度
C．环孢菌素A能够阻断抗器官移植的T细胞的活力
D．2013年初，通过合成生物学手段构建的人工酵母菌菌株，开始大规模工业化生产青蒿酸
B　[药物普伐他丁是胆固醇合成过程中一种酶的抑制剂，临床上能显著降低患者血液中胆固醇的浓度，且副作用小。]
4．酶制剂是发酵工程对工业化生产的又一贡献。下列叙述错误的是(　　)
A．在轻工微生物工业领域，微生物发酵生产了许多酶制剂，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等
B．二肽甜味素(阿斯巴甜)可由嗜热脂肪芽孢杆菌所产的蛋白酶催化生产，与化学工业生产相比，产品价格大幅度下降
C．利用耐高温的水生栖热菌生产的Taq酶制剂具有高耐热性
D．酶制剂可广泛应用于食品工业生产、洗涤剂生产、纺织、皮革、造纸工业等领域，但在医药、临床诊断和食品毒素鉴定中还未涉及
D　[许多酶制剂在医药、临床诊断和食品毒素鉴定中也被广泛应用。]
苹果可用于制作苹果酒、苹果醋饮料和提取具有抗过敏、抗癌细胞增生、调节脂质代谢等多种生理功能的苹果多酚。如图所示为工业化制作苹果酒和苹果醋的装置。
通过本案例培养学生的演绎推理的科学思维能力和实践应用的社会责任感。
(1)甲罐中预留近1/3的空间，目的是什么？(科学思维)
提示：有利于酵母菌的早期繁殖。
(2)甲罐连接的双U型管中一侧注满水的作用是什么？(科学思维)
提示：密闭装置，利于自动化排气；防止发酵液从排气管溢出。
(3)若图中A代表无菌空气，则乙罐排出的气体中氧气的含量有什么变化？(科学思维)
提示：氧气含量降低。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.现代发酵工业大多是采用好氧、液体、深层、分批及单一纯种发酵的方式组合进行的。其中，好氧以及用单一纯种微生物生产单一产品是现代发酵工业的主流。2.选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。将菌种扩大培养才能满足大规模生产的需要。控制发酵过程是保证发酵生产高效顺利进行的重要措施。分离或提纯发酵产品是工业发酵制取产品必经的步骤。3.发酵工程具有生产条件温和、原料丰富且价格低廉、废弃物对环境影响小且容易处理的特点。
1．随着微生物生理学、生物化学研究的深入，以及高产发酵菌株的不断选育，整个微生物工业获得了迅猛发展，下列相关叙述错误的是(　　)
A．好氧、用单一纯种微生物生产单一产品是现代发酵工业的主流
B．选育的高产、优质菌种遗传特性和生产能力稳定
C．发酵工业中发酵罐的大小取决于菌种特性和产物特点
D．菌种在不同的发酵阶段要求的环境条件是不同的
C　[发酵工业中发酵罐的大小取决于生产需要。]
2．分离或提纯发酵产品是工业发酵制取产品必经的步骤，下列相关叙述不正确的是(　　)
A．如果发酵产品是菌体本身，可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来
B．真空发酵是对发酵罐减压，使易挥发的发酵产物从发酵液中分离出来的技术
C．吸附发酵是在发酵过程中加入对发酵产物具有特异性吸附作用的吸附剂，从而使产物从发酵液中分离出来的技术
D．分离后的生物产品还需进一步提纯，经过质检合格后才能成为产品
C　[吸附发酵是在发酵过程中加入对发酵产物具有特异性或非特异性吸附作用的吸附剂，从而使产物从发酵液中分离出来的技术。]
3．发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。下列不属于发酵工程应用的是(　　)
A．利用工程菌生产人生长激素
B．利用啤酒酵母酿造啤酒
C．用培养的人细胞构建人造皮肤
D．用酵母菌生产作为食品添加剂的单细胞蛋白
C　[利用工程菌生产人生长激素利用了发酵工程和基因工程技术，A不符合题意；利用啤酒酵母酿造啤酒属于发酵工程的应用，B不符合题意；用培养的人细胞构建人造皮肤利用了动物细胞工程技术，不属于发酵工程，C符合题意；用酵母菌生产作为食品添加剂的单细胞蛋白属于发酵工程在食品工业上的应用，D不符合题意。]
4．发酵工程广泛应用于多个行业，下列有关叙述错误的是(　　)
A．黑曲霉可作为酿制酱油、生产柠檬酸的菌种
B．啤酒酿制终止后，可得到啤酒、单细胞蛋白等产品
C．用纤维废料发酵得到酒精，可减少环境污染、减缓能源短缺问题
D．用液体培养基可大规模生产新冠病毒减毒疫苗
D　[黑曲霉产生的蛋白酶可将大豆中的蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，进一步加工为酱油，柠檬酸可通过黑曲霉发酵获得，A正确；啤酒酿制终止后，可通过过滤、沉淀等手段获得酵母细胞(单细胞蛋白)，将滤液加工后得到啤酒，B正确；纤维废料分解得到葡萄糖，其经过发酵得到酒精，既减少了环境污染，又减缓了能源短缺问题，C正确；新冠病毒减毒疫苗是新冠病毒经过减毒处理得到的，需用特定的动物细胞进行培养，病毒不能独立地在液体培养基中生长繁殖，D错误。]　传统发酵技术与其他模块知识的交汇点
[核心精要]
交汇点1　酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的细胞结构，联系必修课程模块1中原核细胞与真核细胞的主要区别
(1)相同点：都有细胞膜、细胞质和DNA分子。
(2)不同点：醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，其细胞无核膜、染色体以及线粒体等众多的细胞器，只有核糖体一种细胞器，而酵母菌属于真核生物。
交汇点2　发酵条件的控制，联系必修课程模块1中需氧呼吸和厌氧呼吸的影响因素
(1)果酒的制作前期需要氧，有利于酵母菌进行需氧呼吸而大量繁殖，然后控制为无氧条件，进行酒精发酵。控制发酵温度约为28 ℃。
(2)果醋的制作一直需要充足的氧气，醋酸菌是需氧型细菌，控制发酵温度为30～35 ℃。但泡菜的制作一直需要密封，因为乳酸菌是厌氧型细菌。
[对点训练]
1．下列有关传统发酵技术的应用，叙述正确的是(　　)
A．制作果酒、果醋的菌种属于真核生物，制作腐乳、泡菜的菌种属于原核生物
B．制作果酒、果醋在无氧条件下进行，制作腐乳、泡菜需在有氧条件下进行
C．制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞内酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶
D．制作果酒、果醋的过程需保持菌种活性，制作腐乳、泡菜的过程不需要
C　[制作果酒利用的酵母菌属于真核生物，制作果醋利用的醋酸菌属于原核生物，制作腐乳利用的毛霉属于真核生物，A项错误；制作果酒先在有氧条件下进行，后在无氧条件下进行，制作泡菜需在无氧条件下进行，制作果醋、腐乳需在有氧条件下进行，B项错误；制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞内酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶，C项正确；制作果酒、果醋、腐乳和泡菜的过程中均需保持菌种活性，D项错误。]
2．下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是(　　)
A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母菌的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
C　[据图分析可知，过程①表示细胞呼吸的第一阶段，其在有氧或无氧的条件下都可以进行，且是在细胞溶胶中进行的，而非线粒体中，A、B错误；过程③表示需氧呼吸的第二、三阶段，过程④表示乙醇氧化为醋酸的阶段，过程③和④都必须在有氧的条件下才可以进行，C正确；过程①②③是果酒制作阶段的化学反应，其适宜温度约为28 ℃，过程④是果醋制作阶段的化学反应，其适宜温度为30～35 ℃，D错误。]
3．苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。请回答下列问题。
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的______________中进行，其产物乙醇与____________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________________中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度____________。
(2)第二阶段是在醋酸菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸菌的呼吸作用类型，该过程需要在__________________条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度________(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸菌属于____________核生物，其细胞结构中__________(填“含有”或“不含有”)线粒体。
[解析]　(1)图中过程①和②是酵母菌进行厌氧呼吸产生乙醇的过程，厌氧呼吸的场所是细胞溶胶。乙醇可用酸性重铬酸钾试剂检测，颜色由橙色变为灰绿色。过程③为需氧呼吸的第二和第三阶段，场所为线粒体。在有氧条件下酵母菌进行需氧呼吸，产生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧条件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸菌是好氧细菌，因此，在醋酸菌作用下，将乙醇转变为醋酸的过程需要在有氧条件下才能完成。(3)在生产过程中，第一阶段酵母菌产生乙醇的适宜温度约为28 ℃，第二阶段醋酸菌产生醋酸的适宜温度为30～35 ℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。(4)醋酸菌属于原核生物，原核细胞中的细胞器只有核糖体一种，不含有线粒体。
[答案]　(1)细胞溶胶　酸性重铬酸钾　线粒体　快　(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
　微生物培养技术与其他模块知识的交汇点
[核心精要]
交汇点1　酶的分解作用，联系必修课程模块1中酶的特性
(1)酶具有专一性：一种酶只能催化一种或一类化学反应，如脲酶只能催化分解尿素。
(2)需要温和条件：酶起催化作用需要适宜的温度和pH，因此培养微生物需要控制温度，调节培养基的pH。
交汇点2　培养基中葡萄糖的作用，联系选择性必修课程模块1中血糖的来源和去路
(1)葡萄糖的氧化分解：葡萄糖通过氧化分解释放能量，一部分以热能形式散失，另一部分储存在ATP中，为生命活动提供能量。
(2)三大类物质的相互转化：糖类、脂质和蛋白质三大类物质之间可以相互转化。
交汇点3　培养基中无机盐的作用，联系必修课程模块1、选择性必修课程模块1有关细胞和内环境中无机盐的作用
(1)无机盐的作用：①无机盐是某些化合物的组成成分；②调节生物体的生命活动；③维持渗透压和酸碱平衡。
(2)调节pH的缓冲对：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。
[对点训练]
4．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题。
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是____________
_________________________________________________________________
__________________________________________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________________________________________________
____________________________________________________(答出两点即可)。
[解析]　(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用：作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。若选择“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。
[答案]　(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机营养；作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
5．(2021·广东适应性测试)几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。某些微生物能合成几丁质酶(胞外酶)，使几丁质降解为N 乙酰氨基葡萄糖，然后进一步转化利用。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题。
　 　 　　 　
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以__________为唯一碳源的固体选择性培养基上筛选目标菌株。
(2)培养所筛选出的目标菌株，计算各单菌落周围的“水解圈直径/菌落直径”的比值，比值大小反映了__________________。
(3)科研人员筛选出了产几丁质酶的菌株A。将菌株A发酵产生的几丁质酶粗提液加入盛有马铃薯培养基的培养皿中，涂布均匀后分别接种4种病原真菌，以____________代替几丁质酶粗提液作为对照，结果见图，几丁质酶粗提液对________(填入病原菌编号)的抑菌效果最强。推测几丁质酶的抑菌机理是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
[解析]　(1)筛选过程中，将土壤样品稀释液接种以几丁质为唯一碳源的选择培养基上，在该培养基上只有可以利用几丁质的真菌可以生存，其他不能利用几丁质的微生物被淘汰而达到筛选的作用。(2)水解圈直径/菌落直径可以反映水解能力的大小，水解圈直径/菌落直径越大，说明该菌降解几丁质能力越强，反之越弱。(3)对照组实验应满足单一变量原则，实验组添加几丁质酶，对照组加入不含几丁质酶粗提液的等量的无菌水，对4组实验进行观察比较，d组水解圈直径/菌落直径最大，即抑制效果最强，几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。
[答案]　(1)几丁质　(2)微生物的降解能力　(3)等量的无菌水　 d　几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖

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