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第1节　传统发酵技术的应用
课标内容要求 核心素养对接
举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。 1．生命观念：运用结构功能观认识乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的结构特点和代谢特点。2．科学探究：运用发酵原理，设计并完成利用天然菌种制作泡菜、果酒和果醋的实验探究并对实验结果进行分析和评价。3．社会责任：关注食品安全和健康的生活方式。
一、发酵与传统发酵技术
1．发酵
(1)发酵的历史：约9 000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水果等发酵成含酒精的饮料。1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。
(2)发酵的概念：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵食品——腐乳
(1)原料：豆腐。
(2)参与发酵的微生物：酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
(3)发酵原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸。
3．传统发酵技术
(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
(2)特点：以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
4．下列食品是传统发酵食品的是②③④⑥⑦⑧⑨ 。
①豆腐　②腐乳　③酱油　④香醋　⑤豆油　⑥泡菜　⑦豆豉　⑧馒头　⑨米酒　⑩豆浆　 酸奶　 米饭
二、尝试制作传统发酵食品
1．传统发酵食品制作所利用的微生物
(1)乳酸菌
①代谢特点：厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，反应简式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。
②生产应用：用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。
(2)酵母菌
①代谢特点：单细胞真菌，兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，反应简式为C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。酿酒酵母最适生长温度约为28_℃。
②生产应用：用于酿酒、制作馒头和面包等。
(3)醋酸菌
①代谢特点：好氧细菌，当O2、糖源都充足时能将糖分解成乙酸，反应简式为C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸，反应简式为C2H5OH＋O2CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量。最适生长温度为30～35_℃。
②生产应用：用于制作各种风味的醋。
2．制作泡菜
(1)菌种的来源
利用植物体表面天然的乳酸菌。
(2)方法步骤
配制盐水：用清水和食盐配制质量分数为5%～20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用。
　↓
蔬菜装坛：将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装坛，装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满。
　↓
加盐水：将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过全部菜料。
　↓
封坛发酵：盖好坛盖，向坛盖边沿的水槽中注满水，发酵过程中注意补充水，室温发酵。
3．制作果酒和果醋
(1)菌种来源
新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。
(2)方法步骤
器具消毒：将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。
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冲洗：新鲜葡萄用清水冲洗1～2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。
　↓
榨汁：用榨汁机榨取葡萄汁，装入发酵瓶中，留大约1/3的空间，盖好瓶盖。
　↓
酒精发酵：温度控制在18～30 ℃，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次(注意：不是打开瓶盖)此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12 d。
　↓
醋酸发酵：葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋发酵，温度为30～35 ℃，时间为7～8 d。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．多种微生物参与了腐乳的发酵。 (√)
2．醋酸菌是好氧细菌，乳酸菌和酵母菌是厌氧细菌。 (×)
提示：酵母菌是兼性厌氧真菌。
3．制作葡萄酒的过程中，要定时打开瓶盖放出CO2。 (×)
提示：应拧松瓶盖，不应打开瓶盖。
4．制作泡菜的过程中只有乳酸菌起作用。 (×)
提示：不只是乳酸菌起作用，酵母菌、大肠杆菌等也起作用。
5．传统发酵食品的制作过程中，不同的食品接种不同的菌种。 (×)
提示：传统发酵技术没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。
　泡菜的制作
1．泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量变化的分析
项目 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
初期 少(有氧气，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用)
中期 最多(乳酸抑制其他菌活动) 增多，pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制自身活动) 继续增多，pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化曲线
2．泡菜制作的注意事项
(1)泡菜坛的选择：应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。检查时，可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水现象。
(2)腌制的条件：要注意控制时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
(3)腌制方法：配制质量分数为5%～20%的盐水，盐水要煮沸冷却后备用。蔬菜和配料装至八成满时，加盐水没过全部菜料，盖好坛盖后向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内形成无氧环境，以便乳酸菌发酵。
1．制作泡菜时，营造“无氧环境”的措施有哪些？
提示：(1)选择的泡菜坛要密封性好；(2)加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料；(3)盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
2．为什么泡菜坛只能装八成满？
提示：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，这些微生物是需氧型的，要消耗氧气，因此坛内要留有一定量的氧气。
1．在制作泡菜的过程中，下列叙述不正确的是(　　)
A．按照清水与盐的质量比为1∶2的比例配制盐水
B．配制好的盐水需煮沸冷却
C．腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐用量
D．在坛盖边沿的水槽中要注满水，以保证坛内的无氧环境
A　[在制作泡菜的过程中，用清水和食盐配制质量百分比为5%～20%的盐水，A错误；盐水入坛前要煮沸冷却，煮沸是为了去除氧气并杀灭微生物，冷却是为了避免杀死蔬菜上微生物，保证乳酸菌正常的生命活动，B正确；腌制过程中，要注意控制时间、温度和食盐的用量，以防止杂菌的大量繁殖和亚硝酸盐含量过高，C正确；乳酸菌是异养厌氧型生物，在坛盖边沿的水槽中要注满水，以保证坛内的无氧环境，D正确。]
2．回答下列有关泡菜制作的问题：
(1)制作泡菜时，所用盐水要煮沸，其目的是___________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的目的是________________。
(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵过程即乳酸菌进行___________的过程。该过程发生在乳酸菌的_____________中。
(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有__________、________和________等。
(4)从开始制作到泡菜质量最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸，这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是__________，原因是______________。
[解析]　(1)制作泡菜时需要先形成无菌环境，所用盐水需煮沸，以杀灭盐水中的微生物并除去水中氧气。想要缩短制作时间，应该缩短菌株的生长时间，陈泡菜液中含有一定量的乳酸菌，加入陈泡菜液可以使菌体数量扩增速度加快。(2)乳酸菌为厌氧菌，进行无氧呼吸产生乳酸，该过程只能在细胞质基质中进行。(3)温度过高、腌制时间过短、食盐用量不足等，容易造成杂菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。(4)从开始制作到泡菜质量最佳这段时间内，氧气浓度逐渐降低，泡菜液逐渐变酸，不适宜杂菌生长，而适宜乳酸菌生长，因此乳酸菌数量增加，其他杂菌数量减少。
[答案]　(1)杀灭盐水中的微生物并除去水中氧气　增加乳酸菌的数量　(2)无氧呼吸　细胞质基质　(3)温度　腌制时间　食盐用量　(4)乳酸菌数量增多，杂菌数量减少　乳酸菌比杂菌更耐酸
发酵过程中控制杂菌的方法
(1)泡菜坛的密闭性及灭菌。
(2)蔬菜的清洗可以防止杂菌繁殖。
(3)食盐的用量合适可以控制杂菌的繁殖。
(4)调味料也具有抑菌的作用。
(5)泡菜盐水的浸泡提供的无氧环境为乳酸菌的繁殖提供条件，同时又能抑制好氧菌繁殖。
　果酒和果醋的制作
1．果酒与果醋制作的比较
果酒制作 果醋制作
发酵菌种 来源 附着在葡萄皮上的野生型酵母菌 空气中的醋酸菌
分类地位 单细胞真核生物 单细胞原核生物
繁殖方式 出芽生殖、孢子生殖 二分裂生殖
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型
发酵条件 温度 18～30 ℃ 30～35 ℃
时间 10～12 d 7～8 d
氧气 前期需氧，后期无氧 一直需要充足氧气
pH 酸性 酸性
结果检测 酒精与酸性的重铬酸钾溶液反应呈现灰绿色 反应液pH下降
联系 醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行，酒精发酵为醋酸发酵提供原料
2．发酵过程中酵母菌数量、酒精含量及pH变化分析
(1)果酒发酵过程中酵母菌数量和酒精含量的变化：
①菌体数量的变化：发酵初期，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。发酵中期形成无氧环境，酵母菌数量增加缓慢，最后达到稳定。发酵后期由于酒精含量较高，可能会导致酵母菌大量死亡。
②酒精含量的变化：发酵初期，酵母菌进行有氧呼吸，酒精含量很低。发酵中期，酵母菌进行无氧呼吸产生大量酒精，酒精含量增加。发酵后期，由于酒精含量升高，大量酵母菌死亡，酒精含量不再增加。
(2)果酒、果醋制作过程中pH的变化：
①果酒发酵时产生的部分CO2会溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。
②果醋发酵时产生的醋酸溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。
1．在果酒和果醋制作中，你认为哪些方法可防止发酵液被污染？
提示：(1)冲洗葡萄时应先冲洗再除去枝梗。(2)榨汁机要冲洗干净并晾干。(3)发酵瓶要清洗干净，并用70%的酒精消毒。(4)排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖，防止杂菌污染。
2．果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？
提示：发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。
1．(2020·江苏高考)某同学在线提交了在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋的实验报告，他的做法错误的是(　　)
A. 选择新鲜的葡萄略加冲洗，除去枝梗后榨汁
B. 将玻璃瓶用酒精消毒后，装满葡萄汁
C. 酒精发酵期间，根据发酵进程适时拧松瓶盖放气
D. 酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行醋酸发酵
B　[选择新鲜的葡萄洗1到2次，除去枝梗后榨汁，A正确；葡萄汁不能装满，需装至玻璃瓶的2/3空间，B错误；酒精发酵期间会产生二氧化碳，故需适时拧松瓶盖，防止发酵瓶爆裂，C正确；醋酸菌是好氧菌，故醋酸发酵时应去除瓶盖，加一层纱布，D正确。]
2．(2021·潍坊模拟)“每天喝一点，健康多一点”是某品牌枸杞果酒提出的消费理念。下列为生产该枸杞果酒的传统工艺流程，以下有关分析错误的是(　　)
选料→？→粉碎→灭菌→接种→发酵→？→果酒
A．流程中两处“？”依次表示冲洗和过滤
B．制作枸杞果酒时，温度应该控制在18～30 ℃
C．在酒精发酵旺盛时，若因前期灭菌不合格导致容器中存有醋酸菌，则醋酸菌可将果汁中的糖分解为醋酸
D．可在酸性条件下用重铬酸钾溶液来检验是否有酒精产生
C　[流程中两处“？”依次表示清水冲洗和过滤，过滤的目的是除去果皮等杂质，A正确；由果酒制作的原理可知，制作枸杞果酒时，温度应该控制在18～30 ℃，B正确；在酒精发酵旺盛时，若因前期灭菌不合格导致容器中存有醋酸菌，由于此时为缺氧环境，而醋酸菌为需氧型微生物，在无氧条件下无法生存，因此，醋酸菌不能将果汁中的糖分解为乙酸，C错误；酒精在酸性条件下与重铬酸钾溶液发生颜色反应，由橙色变为灰绿色，以此原理可以来检验是否有酒精产生，D正确。]
葡萄酒是葡萄汁经酵母菌发酵而成的，酿制葡萄酒的两个简易装置如图所示。
甲　　　乙
通过本探究案例能够提高学生对生物学问题进行观察、思考、分析的能力及对实验现象和结果进行交流和讨论的能力。在探究过程中，增强学生的好奇心和求知欲。
(1)试管中的X溶液有助于维持甲装置的瓶中气压相对稳定，与乙装置相比，用甲装置酿制葡萄酒有哪些优点？(科学思维)
(2)葡萄汁装入甲装置时，要留有约1/3的空间，这种做法的目的是什么？(科学思维)
提示：(1)不需要开盖放气；避免了因开盖引起的杂菌污染。
(2)为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气；防止发酵旺盛时汁液溢出。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。2.乳酸菌是厌氧细菌。醋酸菌是好氧细菌。酵母菌是兼性厌氧型真菌。3.直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵，制作食品的技术一般称为传统发酵技术。4.传统发酵食品的制作过程中，没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。
1．下列不属于传统发酵技术的是(　　)
A．通过微生物的培养生产胰岛素
B．果酒和果醋的制作
C．利用乳酸菌发酵制作泡菜
D．利用微生物发酵制作腐乳
A　[传统发酵技术是指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。通过微生物的培养生产胰岛素是现代生物技术——基因工程的应用。]
2．在果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作过程中，用到的微生物分别是(　　)
A．酵母菌、酵母菌、毛霉、乳酸菌
B．酵母菌、醋酸菌、毛霉、乳酸菌
C．毛霉、醋酸菌、乳酸菌、酵母菌
D．酵母菌、乳酸菌、毛霉、醋酸菌
B　[参与果酒制作的微生物是酵母菌；参与果醋制作的微生物是醋酸菌，醋酸菌能将糖源或酒精转变成乙酸；参与腐乳制作的微生物有多种，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉；参与泡菜制作的微生物是乳酸菌。]
3．(2020·福建厦门外国语学校期中)制作泡菜、酸菜时，所用菜坛子必须密封，其原因是(　　)
A．防止水分蒸发
B．防止菜叶萎蔫
C．防止产生的乳酸挥发
D．乳酸菌在有氧条件下发酵被抑制
D　[乳酸菌是厌氧菌，所用菜坛子密封的原因不是防止水分蒸发、防止菜叶萎蔫或防止产生的乳酸挥发，而是为乳酸菌提供无氧环境，防止乳酸菌在有氧条件下发酵被抑制，D项符合题意。]
4．下列关于用塑料瓶制作果酒和果醋的叙述，正确的是(　　)
A．为了提高果酒的产出量，果汁应尽量装满发酵瓶
B．乙酸发酵阶段应封闭瓶口，防止杂菌污染
C．制作果酒过程中每天需适时打开瓶盖
D．果酒制成后，可将装置转移至温度较高的环境中制作果醋
D　[葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间，这样既有利于酵母菌有氧呼吸，大量繁殖，又可防止果酒发酵时产生大量二氧化碳使果汁溢出。乙酸发酵是需氧发酵，应通入氧气，发酵时应敞开瓶口并在瓶口盖上纱布以防杂菌污染。制作果酒过程中定时拧松瓶盖既可排出气体又可避免杂菌污染。醋酸菌发酵的适宜温度比酵母菌高。]
5．下面是果酒和果醋制作的实验流程以及某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。请据图回答下列问题：
图1　　　　　　　图2
(1)图1中方框内的实验流程是_________________________。
(2)冲洗的主要目的是____________________________，
冲洗时应特别注意不能______________，以防菌种的流失。
(3)图2所示装置中的充气口在________时关闭，在________时连接充气泵，并连续不断地向内________。
(4)排气口在果酒制作时排出的气体是由________(填生物名称)产生的________。
[解析]　本题主要考查了果酒、果醋制作的基本过程和原理，同时还考查了两种微生物的代谢类型和生存环境。酵母菌是兼性厌氧微生物，有氧时进行有氧呼吸，无氧时进行酒精发酵，反应式分别为C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量，C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋能量。因此制作果酒时，应在缺氧的环境中进行。醋酸菌是好氧细菌，在氧气、糖源都充足时，其可将葡萄汁中的糖分解成乙酸；在糖源不足时，其可将乙醇变成乙醛，再将乙醛变为乙酸，酒精发酵时的缺氧环境会抑制醋酸菌的生长。在果酒制作过程中排气口排出的气体是由酵母菌产生的CO2。
[答案]　(1)乙酸发酵　(2)除去污物　反复冲洗
(3)酒精发酵　乙酸发酵　泵入空气(或氧气)　(4)酵母菌　CO2第2节　微生物的培养技术及应用
第1课时　微生物的基本培养技术
课标内容要求 核心素养对接
1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室进行微生物分离和纯化的常用方法。 1．科学思维：根据微生物的代谢类型分析培养基的组成；比较消毒和灭菌方法的不同。2．科学探究：讨论并掌握无菌技术的实验操作方法；讨论并掌握微生物的纯培养的方法。
一、培养基的配制
1．培养基
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2．培养基的种类
3．培养基的营养组成
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
4．培养基特殊需求
(1)培养乳酸杆菌时，在培养基中添加维生素。
(2)培养霉菌时，将培养基调至酸性。
(3)培养细菌时，将培养基调至中性或弱碱性。
(4)培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
二、无菌技术
1．无菌技术关键：防止杂菌污染。
2．消毒与灭菌
(1)概念
①消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)类型与方法
连一连：将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。
提示：
3．具体操作
(1)对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
三、微生物的纯培养
1．微生物纯培养的概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
3．酵母菌的纯培养
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(2)纯培养的原理：设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物(单菌落)。
(3)纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(4)酵母菌的纯培养步骤
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。 (×)
提示：液体培养基和固体培养基都含有水，它们的区别为是否含有凝固剂。
2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 (√)
3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。 (×)
提示：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行灭菌。
4．培养基分装到培养皿后进行灭菌。 (×)
提示：培养基分装到培养皿之前要进行灭菌。
5．平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。 (√)
6．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。 (√)
　制备培养基
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用K2HPO4－KH2PO4。
2．培养基的成分及功能
营养物质 作用 功能 主要来源
碳源 能为微生物代谢提供碳元素 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸等
氮源 能为微生物的代谢提供氮元素 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 微生物生长不可缺少的微量有机物 酶和核酸的组成成分；参与代谢过程中的酶促反应 维生素、氨基酸、碱基等
水 是生命活动所必需的 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
1．能够利用无机碳源的微生物的同化作用类型是什么？
提示：能利用无机碳源的微生物的同化作用类型是自养型微生物。
2．牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能够提供哪些营养成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。
1．(2020·吉林三中高二月考)下列有关培养基配制原则的表述，正确的是(　　)
A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、无机盐、水
B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受温度、pH、氧气、渗透压等的影响
D．营养物质的浓度越高越好
C　[培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，但不是必须全部含有，如自养型微生物培养基中可不含碳源，A项错误；碳源和氮源必须具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，B项错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受温度、pH、氧气、渗透压等的影响，C项正确；营养物质的浓度过高可能会造成微生物渗透失水而死亡，D项错误。]
2．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是(　　)
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
D．待培养基冷却凝固后将平板倒过来放置
A　[制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，其顺序不能颠倒，A错误；牛肉膏比较黏稠，所以称好后需将称量纸一同放入烧杯中加热，当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸，B正确；待培养基冷却至50 ℃左右，开始倒平板，C正确；培养基冷却凝固后需将平板倒置，D正确。]
　无菌技术
1．无菌技术的概念：防止外来杂菌的入侵，并保持已灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。
2．无菌技术的目的：
(1)可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
(2)有效避免操作者自身被微生物感染。
3．无菌技术的选择原则
(1)考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
4．无菌技术的方法——灭菌和消毒
灭菌和消毒的种类 主要方法 应用范围
灭菌 湿热灭菌(高压蒸汽灭菌法) 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品
干热灭菌 干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
消毒 煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法 62～65 ℃煮30 min或80～90 ℃煮30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30 W紫外灯照射30 min 接种室空气
化学药物消毒 用体积分数为75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等 皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
1．灭菌和消毒的作用原理是什么？
提示：作用原理是借助理化因素，通过使蛋白质变性来抑制微生物生命活动或杀死微生物。
2．灭菌和消毒的根本区别是什么？
提示：根本区别是芽孢和孢子是否灭活，灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
3．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？
提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。
4．在用酒精消毒时为什么用75%的酒精，而不用100%的酒精？
提示：75%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中。
1．(2020·山东莱州一中高二检测)微生物的实验室培养，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。下列无菌操作中，错误的是(　　)
A．对实验用的培养基，采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌
B．对锥形瓶、塞上棉塞的试管、吸管等，用干热灭菌箱进行灭菌
C．对操作者的双手、衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒
D．对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌
C　[对实验用的培养基，采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，A项正确；对锥形瓶、塞上棉塞的试管、吸管等，用干热灭菌箱进行灭菌，B项正确；对操作者的双手采用酒精进行消毒，C项错误；对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌，D项正确。]
2．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是___________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_____________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是___________________。
[解析]　(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常是采用氯气进行消毒的。(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。
[答案]　(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽
　无菌技术的主要内容
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
　酵母菌的纯培养
1．平板划线法接种和分离酵母菌
(1)平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
(2)平板划线法的注意事项
①灼烧接种环后，要冷却后才能进行操作，以免温度太高杀死菌种。
②第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
③划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
④最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
⑤几次灼烧接种环的目的
灼烧时期 目的
第一次操作(取菌种前) 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物
每次划线之前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
划线结束 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
2．培养酵母菌：接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
3．结果分析与评价
(1)平板划线法结果
平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)如下图所示。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
1．倒平板时，培养基冷凝后，为什么要将平板倒置？
提示：培养基冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。
2．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是作对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
1．下图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是(　　)
A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
B　[由题干图可知，①是倒平板，②是用接种环蘸取菌液，③是进行平板划线，④是培养。①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A正确；倒完平板后应立即盖上培养皿，冷却后将平板倒过来放置，B错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，可以避免培养基中的水分过快地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D正确。]
2．(2020·辽宁沈阳铁路实验中学期中)在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示，且甲、乙的对应位置不变。有关叙述错误的是(　　)
甲　　　乙
A．配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B．甲中a区域为划线的起始位置
C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D．图示接种过程中接种环灼烧了5次
B　[为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行高压蒸汽灭菌，A正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落，C正确；由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，接种过程中接种环灼烧了5次，D正确。]
下表是某种微生物培养基的成分。请思考回答下列问题：
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
通过对某种微生物培养基成分的分析培养学生的物质与能量观、适应观等生命观念，认识生物的多样性、独特性。
(1)该培养基含有微生物生长所需要的营养成分有哪几类？(生命观念)
(2)该培养基可培养什么样的微生物？说明理由。(生命观念)
(3)若除去成分①，加入(CH2O)，该培养基可用于培养什么样的微生物？(科学思维)
提示：(1)该培养基含有的营养成分有三类：水、无机盐和氮源。
(2)该培养基培养的是自养型微生物，因为该培养基中不含含碳有机物。
(3)若除去成分①，加入含碳有机物可用于培养固氮菌。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.各种培养基都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。2.获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。3.消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。4.灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。5.由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。6.菌落是分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
1．不同培养基的具体配方不同，但一般都含(　　)
A．碳源、磷酸盐和维生素
B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐
D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
C　[培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还应考虑pH、特殊营养物质及O2等条件。]
2．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌(　　)
A．接种环、吸管、培养基、接种室
B．吸管、接种环、培养基、接种箱
C．培养基、吸管、接种环、接种箱
D．培养皿、吸管、培养基、双手
B　[干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下加热2～3 h，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min，主要用于培养基灭菌；紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。]
3．(2020·河北邢台期末)下列有关微生物的分离与培养的叙述，错误的是(　　)
A．获得纯培养物的关键是防止杂菌污染
B．倒置平板可防止培养皿盖上的冷凝水滴落造成污染
C．倒平板时将培养皿的盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿
D．检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温箱中培养
C　[获得纯培养物的关键是防止杂菌污染，A正确；倒置平板可防止培养皿盖上的冷凝水滴落造成污染，B正确；倒平板时用食指和拇指夹住皿盖并开启一缝，使其恰好能让锥形瓶瓶口伸入，随后倒入培养基，C错误；检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温箱中培养，D正确。]
4．下列有关平板划线操作的描述，错误的是(　　)
A．将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红
B．接种环在平板上划线的位置是随机的
C．在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰
D．最后一区的划线不能与第一区相连
B　[接种环在平板上划线的位置并不是随机的：将蘸有菌种的接种环伸入平板内，划三至五条平行线后应盖上皿盖，并灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，重复以上操作，在三、四、五区域内划线。]
5．下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、_____和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是_______。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行______处理。
(2)在配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑________、________和渗透压等条件。
(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需进行清洗和________；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质________，还能损伤DNA的结构。
(4)分离纯化微生物最常使用的接种方法是______________。
(5)在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是____________________。
[解析]　(1)培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。培养基配制完成后要调pH和灭菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。(2)配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(3)灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，所以要对培养基和培养皿进行灭菌。消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，故操作者的双手需要进行清洗和消毒。紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。(4)分离纯化微生物常采用平板划线法。(5)培养微生物时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。
[答案]　(1)氮源　牛肉膏和蛋白胨　灭菌　(2)温度　酸碱度　(3)灭菌　消毒　变性　(4)平板划线法　(5)将未接种的培养基放在恒温箱中一段时间，观察培养基上是否有菌落产生第2课时　微生物的选择培养和计数
课标内容要求 核心素养对接
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1．生命观念：通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。2．科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基；总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。3．科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验方法并对实验结果进行评价。
一、选择培养基
1．实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3．选择培养基配方的设计
(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
(2)培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
二、微生物的选择培养
1．方法：对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2．稀释涂布平板法的操作过程
(1)系列梯度稀释操作
(2)涂布平板操作
①取菌液：取0.1_mL菌液，滴加到培养基表面。
②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。
③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
3．培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d，观察。
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)统计依据
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
2．显微镜直接计数：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
四、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．提出问题：如何分离土壤中分解尿素的细菌？每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌？
2．基础知识
组分 含量 提供的主要营养
KH2PO4 1.4 g 无机盐
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g 碳源
尿素 1.0 g 氮源
琼脂 15.0 g 凝固剂
H2O 定容至1 000 mL 水
3．实验设计
(1)土壤取样：先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中。
(2)样品的稀释：一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37_℃的温度下培养1～2天，每隔24_h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (×)
提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。
2．由于使用了选择培养基，因此本实验不需要设置对照组。 (×)
提示：应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
3．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。 (×)
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。
4．在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 (√)
5．当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。 (√)
6．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)
提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
　微生物的选择培养与计数方法
1．选择培养的目的：从众多微生物中分离出需要的特定微生物。
2．筛选微生物常用培养基——选择培养基和鉴别培养基
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
3．稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
(3)计算公式：
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(4)计数结果：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计算结果比实际值偏小。
4．稀释涂布平板法操作注意问题
(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时：
①涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。
(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。
5．显微镜直接计数
(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。
(4)缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
提示：从大豆田土壤取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的土壤中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
1．(2021·河北衡水中学检测)秸秆还田可增加土壤肥力，缓解环境污染。为分离分解纤维素的微生物菌种，实现废物的资源化利用，研究人员设计了“土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌株”的实验流程。下列叙述错误的是(　　)
A．配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之后调节pH
B．选择培养时，应使用纤维素为唯一碳源的培养基
C．进行梯度稀释时，应在酒精灯火焰旁完成各种操作
D．挑选菌株后，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃
A　[配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之前调节pH，避免灭菌之后调节pH造成杂菌污染，A错误；选择培养时，为分离分解纤维素的微生物菌种，应使用纤维素为唯一碳源的培养基，B正确；进行梯度稀释时，为了无菌操作，应在酒精灯火焰旁完成各种操作，C正确；挑选菌株后，为了防止造成污染，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃，D正确。]
2．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
无菌水　　甲　　乙　　 　　甲
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是____________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是____________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_____________。
[解析]　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104
(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
　两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．分离菌种的原理
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖。
2．实验流程示意图
3．实验操作过程
流程 具体操作 操作提示
土壤取样 先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本②将稀释倍数为103～107倍稀释的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作②对所用的平板、试管做好标记③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍稀释的稀释液
培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
4．实验结果分析
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
5．鉴定原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性增强，pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
2．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
3．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B　[利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
2．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
C　[3号试管的稀释倍数为104倍，A项错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B项错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，C项正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，得到的结果往往会比实际活菌数目少，D项错误。]
　实验中的两种“对照组”与“重复组”
(1)两种对照组作用比较。
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基(空白对照组)同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)进行接种培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作为重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式计算活菌数。
微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。如图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。回答下列问题：
通过本案例培养学生的演绎与推理和对实验结果的交流和讨论能力。
(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是什么？(科学思维)
(2)根据D的染色结果，判断B平板中产油脂芽孢杆菌的菌落是哪一个？(科学思维)
(3)采用什么方法将B平板中的产油脂芽孢杆菌的单菌落进一步纯化培养得到E？(科学思维)
提示：(1)将微生物分散成单个细胞，进而获得单个细胞。
(2)3。
(3)平板划线法或稀释涂布平板法。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A　[在A项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌，而B项中无尿素作氮源，C项中缺少碳源，D项中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(　　)
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
A　[统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。]
3．(2020·太原实验中学高二月考)判断选择培养基是否起到了选择作用时，需要设置的对照是(　　)
A.未接种的选择培养基
B.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
D.接种了的选择培养基
B　[选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组，需要用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(　　)
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
D　[在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案]　(1)脲酶　(2)无机盐　只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 　(3)形状、大小　4.2×108　稀释涂布平板法 　(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养第3节　发酵工程及其应用
课标内容要求 核心素养对接
1.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。2．举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。 1．科学思维：基于发酵工程的基本环节和应用实例，阐明发酵工程的概念。2．科学探究：根据发酵产品和利用微生物的不同讨论发酵工程中的发酵条件及控制方法。3．社会责任：认可发酵工程在生产上重要的应用价值。
一、发酵工程的概念和基本环节
1．发酵工程的概念
(1)概念：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品的一项技术。
(2)范围：一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面。
2．发酵工程的基本环节
(1)基本环节：
(2)选一选：下列关于发酵工程基本环节的描述正确的是②④⑤。
①用于发酵工程的菌种应该具备优良性状，并且只能从自然界中筛选。
②在进行发酵前，需要对选育的菌种进行扩大培养。
③发酵工程所用的菌种大多是单一菌种，所以没有必要进行严格的灭菌。
④发酵工程所用的培养基是液体培养基。
⑤在发酵过程中要随时进行检测，还需要对发酵条件进行严格的控制。
⑥发酵结束后即可得到发酵产品。
3．发酵装置
二、发酵工程的应用
1．特点
(1)生产条件温和。
(2)原料来源丰富且价格低廉。
(3)产物专一。
(4)废弃物对环境的污染小和容易处理。
2．在食品工业上的应用
(1)生产传统的发酵产品。
①优点：能明显提高产品的产量和质量。
②实例：
a．大豆中的蛋白质肽和氨基酸酱油
b．啤酒的工业化生产流程：
(2)生产各种各样的食品添加剂：酸度调节剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂等。
(3)生产酶制剂：在食品工业中，经常用到一些酶制剂，如α 淀粉酶、β 淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
3．在医药工业上的应用
(1)发酵工程可以生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等。
(2)基因工程与发酵技术相结合生产所需要的产品。
4．在农牧业上的应用：主要表现在生产微生物肥料、微生物农药、微生物饲料等方面。
5．在其他方面的应用
(1)对解决资源与环境污染问题具有重要意义。
(2)极端微生物的应用。
(3)发酵工程渗透到几乎所有的工农业领域。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．发酵工程利用的菌种都是从自然界中筛选出来的。 (×)
提示：发酵工程的菌种也可以通过诱变育种和基因工程育种获得。
2．发酵工程的中心环节是选育菌种。 (×)
提示：发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵的过程。
3．发酵工程中要对培养基进行灭菌，发酵设备不用灭菌。 (×)
提示：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
4．利用微生物农药防治农林虫害属于化学防治。 (×)
提示：利用微生物农药防治农林虫害属于生物防治。
5．微生物饲料主要是利用发酵工程生产的微生物的菌体。 (√)
　发酵工程的基本环节
1．选育菌种
(1)常用菌种：主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等。
(2)选育方法：
①从自然界中筛选出优良菌种。
②利用诱变育种筛选出符合生产要求的优良菌种。
③利用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，构建出能生产相应产品的菌种。
2．扩大培养：在进行接种前，要进行扩大培养。
(1)目的：增加菌种的数量，缩短生产周期。
(2)方法：将培养到生长速度最快时期的菌体分开，再进行培养。
3．配制培养基
(1)类型：发酵工程一般使用液体培养基。
(2)要求：
①根据不同的菌种，选择不同的材料配制培养基。
②培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH，以利于产物的合成。
③应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。
4．灭菌和接种：在发酵前对培养基和发酵设备进行严格的灭菌处理，接种过程中要注意防止杂菌污染。
5．发酵罐内发酵条件的控制
(1)温度：通过发酵罐上的温度传感器和控制装置进行监测和调整。
(2)溶解氧：通过通气量和搅拌速度加以调节。
(3)pH：通过加料装置添加酸或碱进行调节，也可以在培养基中添加pH缓冲液。
6．分离、提纯产物，获得发酵产品
发酵产品 分离提纯方法
微生物细胞 过滤、沉淀将菌体分离和干燥
代谢物 蒸馏、萃取、离子交换等方法
1．现代发酵工程和传统发酵技术所用菌种的来源有什么差异？
提示：传统发酵技术用的菌种一般是原材料中天然存在的多种菌种，而现代发酵工程用的菌种是通过微生物培养技术获得的单一菌种。
2．与化工生产相比，为什么发酵工程的生产条件比较温和？
提示：发酵是利用微生物的代谢将原料进行转化，而微生物细胞代谢是在常温常压条件下进行的，因此发酵工程的生产条件比较温和。
1．某高校采用如图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是(　　)
A．夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B．乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C．正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D．可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
B　[果酒发酵的适宜温度为18～30 ℃，因此夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理，A正确；乙醇是酵母菌无氧呼吸的产物，因此分解过程中不需要通入空气，B错误；无氧呼吸产生了二氧化碳，但是没有消耗氧气，因此发酵罐中的气压不会低于大气压，C正确；葡萄酒发酵的原料是糖类，因此可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵，D正确。]
2．发酵工程在工业生产上得到广泛应用，其生产流程如下图所示。结合赖氨酸或谷氨酸的生产实际，回答相关问题。
(1)图中①表示的育种方法是________________。
(2)人工控制微生物代谢的措施包括____________和_____________。
(3)在赖氨酸或谷氨酸发酵过程中，产物源源不断地产生，这说明该生产采用了________的发酵方式。在生产过程中，常需增加通氧量，因此判断赖氨酸或谷氨酸发酵菌种为________菌。
(4)当发酵生产的产品是代谢产物时，还要采用________等分离提纯的方法进行提取。
[解析]　基因工程、细胞工程和诱变育种是发酵工程菌种的来源。控制微生物代谢的措施包括两个方面：一方面是改变微生物的遗传特性，另一方面是控制微生物的生长繁殖条件。在发酵生产中，产物源源不断地产生，因此发酵过程是连续的。发酵生产的产品是代谢产物，分离提取产物的方法有萃取、蒸馏和离子交换等。
[答案]　(1)诱变育种　(2)改变微生物遗传特性　控制生产过程中的各种条件　(3)连续培养　好氧　(4)萃取(或蒸馏或离子交换等)
　发酵罐使用的三点提醒
(1)发酵罐在使用前要进行灭菌，培养基和发酵设备一般用蒸汽灭菌，空气采用过滤的方法除菌。
(2)对于需氧发酵，为了防止杂菌污染，应该从空气入口通入无菌空气。
(3)搅拌的作用：
①使空气和发酵液充分混合，增加培养液中的溶解氧。
②使菌种与培养液充分接触，提高原料利用率。
　发酵工程的应用
1．发酵工程的应用：发酵工程渗透到几乎所有的工农业领域。
(1)在食品工业上的应用：生产传统的发酵产品、食品添加剂和酶制剂。
(2)在医药工业上的应用：生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等。
(3)在农牧业上的应用：生产微生物肥料、微生物农药、微生物饲料等。
2．发酵工程与传统发酵技术的比较
发酵工程 传统发酵技术
不同点 菌种 通过微生物纯培养技术筛选或其他技术生产的优良菌种，大多是单一菌种 原材料中天然存在的混合菌种
发酵方式 液体发酵为主 固体发酵或半固体发酵为主
对发酵条件的控制 严格无菌操作，防止杂菌污染。通过现代工程技术对发酵条件精确地控制，使发酵条件处于最佳状态 不是无菌操作，容易受到杂菌污染。对发酵条件不能严格控制，易受外界条件影响
生产规模和产品 生产规模大，实现了工业化生产。原料来源丰富，成本低，产物多样，产量高 通常是家庭式或作坊式的，产量低，生产往往受季节和原料限制，产品风味品种比较单一，质量不稳定
相同点 ①都是利用了微生物的作用②发酵工程是在传统发酵技术的基础上发展起来的
1．微生物肥料使作物增产的原理是什么？
提示：微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质能增进土壤肥力、改良土壤结构，促进植物生长。
2．微生物农药防治农林害虫的原理是什么？
提示：微生物农药是利用微生物或其代谢产物来防治病虫害的。
1．下列有关发酵工程应用的叙述，正确的是(　　)
A．发酵完成后分离出的菌体均可作为动物饲料
B．发酵工程不能用于传统发酵食品的生产
C．利用基因工程选育的菌种可用于酶制剂、疫苗、激素等的生产
D．将发酵液中的微生物分离出来就是微生物肥料，可大大增进土壤肥力
C　[有些微生物的菌体含有激素、抗生素等，不适合作为动物饲料，A错误；利用发酵工程能生产传统发酵食品，B错误；微生物肥料是指微生物代谢产生的有机酸、生物活性物质等，D错误。]
2．发酵工程广泛应用于多个行业，下列有关叙述错误的是(　　)
A．黑曲霉可作为酿制酱油、生产柠檬酸的菌种
B．啤酒酿制终止后，可得到啤酒、单细胞蛋白等产品
C．用纤维废料发酵得到酒精，可减少环境污染、减缓能源短缺问题
D．用液体培养基可大规模生产新冠病毒减毒疫苗
D　[黑曲霉产生的蛋白酶可将大豆中的蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，进一步加工为酱油，柠檬酸可通过黑曲霉发酵获得，A正确；啤酒酿制终止后，可通过过滤、沉淀等手段获得酵母细胞(单细胞蛋白)，将滤液加工后得到啤酒，B正确；纤维废料分解得到葡萄糖，其经过发酵得到酒精，既减少了环境污染，又减缓了能源短缺问题，C正确；新冠病毒减毒疫苗是新冠病毒经过减毒处理得到的，需用特定的动物细胞进行培养，病毒不能独立地在液体培养基中生长繁殖，D错误。]
苹果可用于制作苹果酒、苹果醋饮料和提取具有抗过敏、抗癌细胞增生、调节脂质代谢等多种生理功能的苹果多酚。如图所示为工业化制作苹果酒和苹果醋的装置。
通过本案例培养学生的演绎推理的科学思维能力和实践应用的社会责任感。
(1)甲罐中预留近1/3的空间，目的是什么？(科学思维)
(2)甲罐连接的双U型管中一侧注满水的作用是什么？(科学思维)
(3)若图中A代表无菌空气，则乙罐排出的气体中氧气的含量有什么变化？(科学思维)
提示：(1)有利于酵母菌的早期繁殖。
(2)密闭装置，利于自动化排气；防止发酵液从排气管溢出。
(3)氧气含量降低。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。2.发酵工程所用的菌种大多是单一菌种。3.发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵。4.如果发酵产品是微生物菌体可采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品；如果发酵产品是微生物的代谢物可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。5.发酵工程的产品主要包括微生物的代谢产物、酶及微生物的菌体。
1．发酵工程的正确操作过程是(　　)
①发酵　②培养基的配制　③灭菌　④产品的分离与提纯　⑤菌种的选育　⑥扩大培养和接种
A．①③④⑤②⑥ B．⑤②③⑥①④
C．②⑤③①⑥④ D．⑥⑤②④③①
B　[发酵工程的基本环节中，第一个环节是菌种的选育，最后一个环节是产品的分离与提纯，B项正确。]
2．关于发酵工程的菌种说法错误的是(　　)
A．发酵工程的菌种可以从自然界中筛选出来
B．发酵工程可以利用原材料中含有的菌种
C．发酵工程的菌种可以来自基因工程
D．发酵工程的菌种可以来自诱变育种
B　[传统发酵技术利用的是原材料中含有的菌种，发酵工程利用的是经过筛选或培育的菌种。]
3．严格控制发酵条件是保证发酵正常进行的关键，直接关系到是否能得到质量高、产量多的理想产物，通常所指的发酵条件不包括(　　)
A．温度控制　　 B．溶氧控制
C．pH控制 D．酶的控制
D　[通常所指的发酵条件包括温度、pH、溶氧、通气与转速等。酶是自身调节物质，不属于发酵条件。]
4．关于啤酒生产的流程说法错误的是(　　)
A．让大麦种子发芽的目的是释放淀粉酶
B．焙烤发芽的大麦种子时，淀粉酶丧失活性
C．糖化的目的是让淀粉分解
D．蒸煮时终止了酶的作用，并对糖浆进行灭菌
B　[焙烤发芽的大麦种子时杀死大麦种子，但不能使淀粉酶丧失活性。]
5．如图所示是发酵工程生产产品的流程图，据图回答下列问题：
(1)发酵工程中，选育优良性状的菌种，至关重要。高产青霉素菌种是通过________育种获得的，啤酒酵母菌是通过________改造的。
(2)图中①表示________，这样做的目的是______________。
(3)③表示___________，是整个过程的中心环节，在此阶段需随时取样、检测_______、________等，以了解发酵进程，还要及时添加___________，同时严格控制____________等发酵条件。
(4)④表示______，发酵结束后可采用______等方法获得产品。
[解析]　(1)高产青霉素菌种是通过诱变育种获得的，啤酒酵母菌是通过基因工程改造的。(2)图中①表示扩大培养，目的是增加菌种的数量，缩短生产周期。(3)③是整个过程的中心环节——发酵罐内发酵，在此阶段需随时取样、检测微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。随着发酵进行，培养基中的营养物质减少，还要及时添加必需的营养组分，同时严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。(4)④是发酵工程产品微生物细胞(菌体)，发酵结束后可采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。
[答案]　(1)诱变　基因工程　(2)扩大培养　增加菌种的数量，可以缩短生产周期　(3)发酵罐内发酵　微生物数量　产物浓度　必需的营养组分　温度、pH和溶解氧　(4)微生物细胞(菌体)　过滤、沉淀　传统发酵技术与其他模块知识的交汇点
[素能建构]
交汇点1　酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的细胞结构，联系必修课程模块1中原核细胞与真核细胞的主要区别
(1)相同点：都有细胞膜、细胞质和DNA分子。
(2)不同点：醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，其细胞无核膜、染色体以及线粒体等众多的细胞器，只有核糖体一种细胞器，而酵母菌属于真核生物。
交汇点2　发酵条件的控制，联系必修课程模块1中有氧呼吸和无氧呼吸的影响因素
(1)果酒的制作前期需要氧，有利于酵母菌进行有氧呼吸而大量繁殖，然后控制为无氧条件，进行酒精发酵。控制发酵温度约为28 ℃。
(2)果醋的制作一直需要充足的氧气，醋酸菌是需氧型细菌，控制发酵温度为30～35 ℃。但泡菜的制作一直需要密封，因为乳酸菌是厌氧型细菌。
[对应练习]
1．下列有关传统发酵技术的应用，叙述正确的是(　　)
A．制作果酒、果醋的菌种属于真核生物，制作腐乳、泡菜的菌种属于原核生物
B．制作果酒、果醋在无氧条件下进行，制作腐乳、泡菜需在有氧条件下进行
C．制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞内酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶
D．制作果酒、果醋的过程需保持菌种活性，制作腐乳、泡菜的过程不需要
C　[制作果酒利用的酵母菌属于真核生物，制作果醋利用的醋酸菌属于原核生物，制作腐乳利用的毛霉属于真核生物，A项错误；制作果酒先在有氧条件下进行，后在无氧条件下进行，制作泡菜需在无氧条件下进行，制作果醋、腐乳需在有氧条件下进行，B项错误；制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞内酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶，C项正确；制作果酒、果醋、腐乳和泡菜的过程中均需保持菌种活性，D项错误。]
2．下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是(　　)
A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母菌的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
C　[据图分析可知，过程①表示细胞呼吸的第一阶段，其在有氧或无氧的条件下都可以进行，且是在细胞质基质中进行的，而非线粒体中，A、B错误；过程③表示有氧呼吸的第二、三阶段，过程④表示乙醇氧化为醋酸的阶段，过程③和④都必须在有氧的条件下才可以进行，C正确；过程①②③是果酒制作阶段的化学反应，其适宜温度约为28 ℃，过程④是果醋制作阶段的化学反应，其适宜温度为30～35 ℃，D错误。]
3．苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。请回答下列问题：
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的______________中进行，其产物乙醇与____________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________________中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度____________。
(2)第二阶段是在醋酸菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸菌的呼吸作用类型，该过程需要在______________条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度________(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸菌属于_______核生物，其细胞结构中_______(填“含有”或“不含有”)线粒体。
[解析]　(1)图中过程①和②是酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇的过程，无氧呼吸的场所是细胞质基质。乙醇可用酸性重铬酸钾试剂检测，颜色由橙色变为灰绿色。过程③为有氧呼吸的第二和第三阶段，场所为线粒体。在有氧条件下酵母菌进行有氧呼吸，产生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧条件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸菌是好氧细菌，因此，在醋酸菌作用下，将乙醇转变为醋酸的过程需要在有氧条件下才能完成。(3)在生产过程中，第一阶段酵母菌产生乙醇的适宜温度约为28 ℃，第二阶段醋酸菌产生醋酸的适宜温度为30～35 ℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。(4)醋酸菌属于原核生物，原核细胞中的细胞器只有核糖体一种，不含有线粒体。
[答案]　(1)细胞质基质　酸性重铬酸钾　线粒体　快
(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
　微生物培养技术与其他模块知识的交汇点
[素能建构]
交汇点1　酶的分解作用，联系必修课程模块1中酶的特性
(1)酶具有专一性：一种酶只能催化一种或一类化学反应，如脲酶只能催化分解尿素。
(2)需要温和条件：酶起催化作用需要适宜的温度和pH，因此培养微生物需要控制温度，调节培养基的pH。
交汇点2　培养基中葡萄糖的作用，联系选择性必修模块1中血糖的来源和去路
(1)葡萄糖的氧化分解：葡萄糖通过氧化分解释放能量，一部分以热能形式散失，另一部分储存在ATP中，为生命活动提供能量。
(2)三大类物质的相互转化：糖类、脂质和蛋白质三大类物质之间可以相互转化。
交汇点3　培养基中无机盐的作用，联系必修课程模块1、选择性必修模块1有关细胞和内环境中无机盐的作用
(1)无机盐的作用：①无机盐是某些化合物的组成成分；②调节生物体的生命活动；③维持渗透压和酸碱平衡。
(2)调节pH的缓冲对：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。
[对应练习]
1．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是___________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________(答出两点即可)。
[解析]　(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用：作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。若选择“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。
[答案]　(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机营养；作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．(2021·广东适应性测试)几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。某些微生物能合成几丁质酶(胞外酶)，使几丁质降解为N 乙酰氨基葡萄糖，然后进一步转化利用。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题：
　　　
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以__________为唯一碳源的固体选择性培养基上筛选目标菌株。
(2)培养所筛选出的目标菌株，计算各单菌落周围的“水解圈直径/菌落直径”的比值，比值大小反映了__________________。
(3)科研人员筛选出了产几丁质酶的菌株A。将菌株A发酵产生的几丁质酶粗提液加入到盛有马铃薯培养基的培养皿中，涂布均匀后分别接种4种病原真菌，以_________代替几丁质酶粗提液作为对照，结果见图，几丁质酶粗提液对________的抑菌效果最强(填入病原菌编号)。推测几丁质酶的抑菌机理是______________________。
[解析]　(1)筛选过程中，将土壤样品稀释液接种以几丁质为唯一碳源的选择培养基上，在该培养基上只有可以利用几丁质的真菌可以生存，其他不能利用几丁质的微生物被淘汰而达到筛选的作用。(2)水解圈直径/菌落直径可以反映水解能力的大小，水解圈直径/菌落直径越大，说明该菌降解几丁质能力越强，反之越弱。(3)对照组实验应满足单一变量原则，实验组添加几丁质酶，对照组加入不含几丁质酶粗提液的等量的无菌水，对4组实验进行观察比较，d组水解圈直径/菌落直径最大，即抑制效果最强，几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。
[答案]　 (1)几丁质　(2)微生物的降解能力　(3)等量的无菌水　 d　几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖

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