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高考生物二轮复习专题突破
专题十　生物工程
[课标内容]　1.植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术。2.动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术。3.对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体。4.基因工程是一种DNA重组技术。5.蛋白质工程是基因工程的延伸。6.生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全与伦理问题。7.依据生态学原理保护环境是人类生存和可持续发展的必要条件。
梳理核心知识
提示　深思1：第三步将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象。
深思2：脱分化和再分化。
1.初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，因此在整个生命过程中它一直进行着。初生代谢物有糖类、脂质、蛋白质和核酸等。次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。
2.动物细胞培养过程中，常用幼龄的动物细胞，因为幼龄动物的细胞、分化程度低的细胞更易于培养。细胞的分化程度越低，其分裂能力就越强。
3.动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞的原因：胃蛋白酶适于在较强的酸性条件下发挥作用，而较强的酸性条件会对贴壁细胞造成伤害。
4.灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。
5.在选择性培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
6.抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC的抗体具有特异性识别肿瘤细胞的作用，药物有杀伤肿瘤细胞的作用。
7.艾弗里等人通过不同类型肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
8.限制酶不能切割自身DNA的原因：原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
9.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
10.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
1.判断有关动植物细胞工程和胚胎工程说法的正误
（1）在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不会发生细胞的增殖和分化。（×）
（2）愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。（×）
（3）用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性。（×）
（4）植物体细胞杂交所获得的杂种植株的变异类型属于染色体变异。（√）
（5）肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸。（×）
（6）杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。（√）
（7）卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加。（×）
（8）在胚胎发育过程中，细胞的分化出现在桑葚胚期。（×）
（9）胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的囊胚或原肠胚。（×）
2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误
（1）DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。（×）
（2）E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。（×）
（3）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。（×）
（4）用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。（√）
（5）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。（×）
（6）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。（×）
（7）基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。（√）
1.[2017·全国卷Ⅰ，38（5）]艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
2.[2017·全国卷Ⅱ，38（2）]以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
3.[2019·全国卷Ⅰ，38（3）]目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
4.[2017·全国卷Ⅱ，38（3）]若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答出两点即可）。
提示　目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子
5.[2018·全国卷Ⅲ，38（1）]“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中
6.在动物细胞核移植获得克隆动物时用卵母细胞作受体细胞原因是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　卵母细胞大利于操作，细胞质中有使细胞核基因得以表达的物质和条件
7.胚胎移植时对同种哺乳动物供受体进行同期发情处理的原因是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　使供受体处于相同的生理状态
1.（2020·山东等级考，14）经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是（　　）
A.用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子
B.体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理
C.胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植
D.遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得
答案　C
解析　为获得更多卵子，需要用促性腺激素对雌性个体进行超数排卵处理，A正确；刚排出的精子不能与卵子受精，必须进行获能处理后才具备受精能力，B正确；胚胎移植前要检查胚胎质量，牛、羊等一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段才进行移植，小鼠等可在更早的阶段移植，C错误；可通过转基因等技术获得遗传改造的小鼠胚胎干细胞，D正确。
2.（2021·全国乙卷，38）[生物——选修3：现代生物科技专题]
用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切酶核酸的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中　　　　酶切割后的DNA片段可以用E·coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是　　　　　　　　　　　　。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指___________________________________。
答案　（1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　（2）磷酸二酯键　（3）自我复制　限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　（4）RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析　（1）由题图可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E·coliDNA连接酶可用于连接黏性末端，T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
3.（2020·全国卷Ⅲ，38）[生物——选修3：现代生物科技专题]W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
回答下列问题：
（1）步骤①中需要使用的工具酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。步骤②和③所代表的操作分别是　　　　和　　　　。步骤④称为　　　　。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的　　　　　　（答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息　　　　（填“相同”或“不同”），原因是______________________________________________________________________。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有　　　　　（答出2点即可）。
答案　（1）限制性内切核酸酶、DNA连接酶　显微注射　体外培养　胚胎移植　（2）性别、年龄　（3）相同　两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵
（4）体外受精、胚胎移植
解析　（1）步骤①是基因表达载体的构建过程，该过程需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶，用限制酶分别切割载体和目的基因，用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。步骤②和③所代表的操作分别是显微注射和体外培养。步骤④是将早期胚胎植入到代孕母体内，称为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的性别和年龄的限制。（3）乳腺上皮细胞和膀胱上皮细胞都是体细胞。一般来说，在同一动物个体中，其体细胞都是由同一个受精卵分裂、分化而来的，细胞在分裂、分化过程中，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息一般是不变的，因此两种上皮细胞的染色体DNA所含的遗传信息相同。（4）据题述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技术有体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植等。
微专题1　动植物细胞工程与胚胎工程
1.植物组织培养的过程　原理：植物细胞的全能性
提醒：①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。
③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
④体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2.植物体细胞杂交技术
原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
3.动物细胞培养　原理：细胞增殖
提醒：①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
4.动物体细胞克隆技术（核移植技术）
原理：动物细胞核的全能性
提醒：核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：
①克隆动物遗传物质来自两个亲本。
②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
③外界环境可能引起不可遗传的变异。
5.单克隆抗体的制备　原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
6.胚胎移植的操作流程及生理基础
（1）操作流程
提醒：①精子获能的方法有培养法和化学诱导法。
②卵母细胞须培养到MⅡ中期才能参与受精。
③细胞分化开始于囊胚，桑葚胚的形成没有经过细胞分化。
④囊胚的内细胞团具有全能性，将来发育成胎儿的各种组织。
（2）生理基础
7.胚胎分割　无性繁殖或克隆
1.(2021·河南南阳市一中调研)随着对植物组织培养技术的深入研究，其操作流程不断改进和完善，该技术在我们的生产和生活中的应用越来越普遍。如图是将胡萝卜的某组织通过植物组织培养技术培养成植株的简化流程。请回答下列有关问题：
(1)在切取胡萝卜块时，往往强调要切取含有容易诱导形成愈伤组织的________________部分。图中①②过程分别是________________、________________，两过程所用的培养基存在不同之处，主要是____________________________。
(2)从细胞水平看，图中③过程主要是通过________________________________两个步骤来完成的。图中全过程表明，分化的植物细胞内仍具有________________________________。
(3)植物组织培养技术的应用越来越广泛，例如利用该技术培育无病毒草莓苗，一般选取茎尖或根尖作为外植体，其原因是__________________________________
______________________________________________________________________。
请列举该技术的其他应用：______________________________________________
_________________________________________________________(列举两类)。
答案　(1)形成层　脱分化　再分化　培养基中植物激素比例不同　(2)细胞分裂和细胞分化　形成完整植株所需要的全部基因　(3)植物分生区附近(如茎尖、根尖)的病毒极少，甚至无病毒　快速繁殖植物(微型繁殖)、制造人工种子、单倍体育种、体细胞诱变育种、细胞产物的工厂化生产等(任选两个，合理即可)
解析　(1)在切取胡萝卜组织块时强调要含有形成层部分，因为该部分容易诱导形成愈伤组织。图中①为脱分化，②为再分化，③表示胚状体生长发育为植株的过程；①②过程所用的培养基中都应含有营养物质和植物激素，①过程是脱分化，其培养基中生长素含量高于细胞分裂素，②过程为再分化，其培养基中生长素含量低于细胞分裂素，所以两过程所用的培养基主要不同之处是培养基中植物激素比例不同。(2)图中③表示胚状体生长发育为植株的过程，生物的生长发育是通过细胞分裂和细胞分化两个步骤完成的。图中全过程反映的是将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成了完整的植株，该过程说明分化的植物细胞内仍具有形成完整植株所需要的全部基因。(3)科学家们发现植物分生区附近(如茎尖、根尖)的病毒极少，甚至无病毒，因此，切取一定大小的茎尖或根尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。现在植物组织培养技术得到了广泛应用，如快速繁殖植物(微型繁殖)、制造人工种子、单倍体育种、体细胞诱变育种以及细胞产物的工厂化生产等。
2.(2021·合肥市调研)新冠病毒，即2019 nCoV，是一种RNA病毒，其结构模式图如下。其中S蛋白是2019 nCoV表面主要抗原，利用S蛋白可以制作相应的抗体，据此回答下列问题：
(1)采用基因工程的方法，可以获取大量S蛋白。获取方法是提取2019 nCoV的RNA，通过____________过程获取相应的cDNA。
(2)通过基因工程技术获取S蛋白，最关键的一步是__________________________
_____________________________________________________________________。
(3)将S蛋白注入小鼠等动物体内，通过单克隆抗体技术，即可获得抗S蛋白的单克隆抗体。与新冠肺炎康复者捐献的血浆中的抗体相比，抗S蛋白的单克隆抗体的优点是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)在对新冠肺炎疑似患者的检测中，利用核酸检测法，有时会出现假阴性现象，在分子水平上还可以利用________________________技术进行检测。
答案　(1)逆转录(反转录)　(2)基因表达载体的构建　(3)能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可大量别备　(4)抗原和抗体杂交
解析　(1)以病毒的RNA为模板，通过逆转录过程可获取相应的cDNA。(2)基因工程中最关键的步骤是基因表达载体的构建。(3)通过单克隆抗体技术获得的抗S蛋白的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、并可能大量制备等优点。(4)在分子水平上检测新冠肺炎疑似患者除了可以利用核酸检测法外，还可以利用抗体能够和抗原特异性结合的特点，即抗原和抗体杂交技术进行检测。
3.(2021·河南百校联盟)据图回答下列问题。
(1)图中雌鼠进行激素注射的目的是_____________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)胚胎的收集可以通过人工方法从雌鼠输卵管内获得，该过程称为________________。将胚胎在相关培养液中进行早期培养，目的是____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
培养液中除含有有机盐、无机盐、血清外，还需加入的四种主要物质是____________________。
(3)图中目的基因表达载体通过________________法进入胚胎细胞，胚胎发育的早期称为卵裂期，其特点是_______________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)图中将结扎雄鼠与雌鼠交配，可获得假孕鼠，其目的是
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
图中①是指____________。
答案　(1)促使雌鼠超数排卵　(2)冲卵　便于检查受精状况和受精卵的发育能力　维生素、激素、氨基酸、核苷酸　(3)显微注射　细胞分裂方式为有丝分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，或略有缩小　(4)使假孕鼠生殖器官的生理变化与供体相同，从而为供体胚胎移入假孕鼠提供相同的生理环境(合理即可)　胚胎移植
解析　(1)图中雌鼠注射的激素是促性腺激素，目的是促使雌鼠超数排卵。(2)胚胎的收集可以通过人工方法从雌鼠输卵管内获得，该过程称为冲卵。冲出的胚胎移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。胚胎的培养液成分除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。(3)图中目的基因表达载体通过显微注射法进入胚胎细胞，胚胎发育的早期称为卵裂期，其特点是细胞分裂方式为有丝分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，或略有缩小。(4)图中将结扎雄鼠与雌鼠交配，可获得假孕鼠，其目的是使假孕鼠生殖器官的生理变化与供体相同，从而为供体胚胎移入假孕鼠提供相同的生理环境。图中①是指胚胎移植。
4.(2021·河南开封模拟)科学家通过导入外源分子使动物的某特定基因失活。进而培养出有基因缺陷的动物来研究相应基因的功能。如图是流程示意图。请据图回答相关问题。
(1)①过程通常用到____________(仪器)，②过程所采取避免杂菌污染措施，除培养液及培养用具灭菌处理外，一般需加入____________，还要定期更换培养液。定期更换培养液的理由是_______________________________________________。
(2)图示体外受精过程，一般需要在________中完成。
(3)为更多地获得基因剔除小鼠，可对囊胚阶段的胚胎进行分割移植，在分割时要注意________________。请说明理由______________________________________。
(4)胚胎移植能否成功，主要与供体和受体的________________有关。
(5)经研究得知，某基因与乳腺癌细胞的增殖密切相关。请简述基因剔除技术在乳腺癌治疗方面的基本思路：_______________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)显微注射仪　一定量的抗生素　清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害　(2)专用的受精溶液(或获能溶液)　(3)对内细胞团进行均等分割　若不均等分割，会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育　(4)生理状况
　(5)通过基因剔除技术使该基因失活，从而阻止乳腺细胞的癌变
解析　(1)图中①过程将体外转录后mRNA导入受精卵常用显微注射技术。②是早期胚胎培养过程，除培养液及培养用具灭菌处理外，一般需加入一定量的抗生素(防止染菌)，还要定期更换培养液。定期更换培养液的目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。(2)体外受精过程，一般需要在获能溶液或专用的受精溶液中完成。(3)对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要对内细胞团进行均等分割，因为内细胞团将来发育成胎儿的组织器官，若不均等分割，会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。(4)胚胎移植能否成功，主要与供体和受体的生理状况有关，应将早期胚胎移植到同期发情的代孕母体内。(5)某基因与乳腺癌细胞的增殖密切相关，则可通过基因剔除技术使该基因失活，从而阻止乳腺细胞癌变。
微专题2　基因工程
1.基因工程的3种基本工具
2.基因工程的操作流程
(1)目的基因的获取
提醒：①从cDNA文库获取的目的基因不含启动子和终止子。
②PCR过程中需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
提醒：①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
②启动子、终止子
a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
③目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
④利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连接到一起。
(3)将目的基因导入受体细胞
提醒：农杆菌转化法中的“两个两次”
(4)目的基因的检测与鉴定
3.蛋白质工程
1.(2021·中原名校联盟)糖尿病是一种常见病，且发病率有逐年增加的趋势，以致西方发达国家把它列为第三号“杀手”。治疗该病的胰岛素过去主要从动物(如猪、牛)中获得。自20世纪70年代遗传工程(又称基因工程)发展起来以后，人们开始采用这种高新技术生产胰岛素，其操作的基本过程如下图所示：
(1)图中基因工程的基本过程可概括为“四步曲”，即______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(2)图中的质粒存在于细菌细胞内，在基因工程中通常被用作________，从其分子结构可确定它是一种________。
(3)根据碱基互补配对的规律，在DNA连接酶的作用下，把图中甲与乙拼接起来(即重组)，若a段与d段的碱基序列分别是AATTC和CTTAA，则b段与c段分别是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(4)细菌进行分裂后，其中被拼接起来的质粒也由一个变成两个，两个变成四个……质粒的这种增加方式在遗传学上称为________。目的基因通过活动(即表达)后，能使细菌产生治疗糖尿病的激素。这是因为基因具有控制________合成的功能，它的过程包括____________________。
答案　(1)目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定
(2)载体　环状DNA　(3)TTAAG、GAATT　(4)DNA分子的扩增(复制)　蛋白质　转录和翻译
2.(2021·襄阳五中调研)农作物的增产常常需要使用除草剂，但强力除草剂往往对农作物有毒害作用。近年来，科学家利用基因工程技术获得了多种转基因农作物新品种，包括抗除草剂的转基因烟草，下图表示其技术路线，其中含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能使无色物质K呈现蓝色。回答下列问题：
(1)基因工程是在________水平对生物的遗传性状加以改造的，相较于传统的育种方式，它的优点是____________________________________________。图示技术路线中，为了成功构建载体，需使用限制酶分别对___________________________进行酶切。
(2)为了提高基因工程的成功率，需要利用标记基因对转化后的农杆菌进行筛选，图中属于标记基因的是____________________________。若筛选1的目的是淘汰未导入目的基因的农杆菌，应在培养基中添加____________________。
(3)若农杆菌未成功转化愈伤组织，仅残留在愈伤组织表面，会导致未转化的愈伤组织也能在含除草剂的培养基中生长，为避免这种情况发生，筛选2应进行的具体操作是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)利用获得的转基因烟草进行扩大生产，常采用微型繁殖的方法，该方法利用的原理是____________________。
答案　(1)分子　能够定向改造生物性状，克服远缘杂交不亲和的障碍　含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti质粒上的T DNA
(2)氨苄青霉素抗性基因和报告基因　氨苄青霉素
(3)在培养基中加入除草剂和物质K，从存活的愈伤组织中挑选呈蓝色的愈伤组织进行植物组织培养(答案合理即可)
(4)植物细胞的全能性
解析　(1)基因工程是在分子水平上对生物的遗传性状加以改造的，相较于传统的育种方式，它的优点是能够定向改造生物性状，克服远缘杂交不亲和的障碍，为了成功构建表达载体，需使用限制酶分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti质粒上的T DNA进行酶切。(2)题图中属于标记基因的是氨苄青霉素抗性基因和报告基因，可以用来进行筛选。未导入目的基因的农杆菌不含氨苄青霉素抗性基因，不能在含氨苄青霉素的培养基中生长。(3)进行筛选2操作时，首先需要加入除草剂进行筛选，但这种情况不能避免农杆菌未成功转化愈伤组织，仅残留在愈伤组织表面造成干扰，因而还需要利用报告基因。报告基因只能在真核细胞中表达，在培养基中加入物质K，农杆菌成功转化的愈伤组织会呈现蓝色。故筛选2应进行的具体操作为在培养基中加入除草剂和物质K，从存活的愈伤组织中挑选呈蓝色的愈伤组织进行植物组织培养。(4)微型繁殖利用的是植物组织培养技术，其原理是植物细胞的全能性。
3.(2021·陕西省部分学校摸底调研)穿梭载体是一类具有两种不同复制原点、能在两种不同的生物体(物种不同)中复制的载体，一般在原核生物和真核生物中都能复制和表达，如Ti质粒和哺乳动物表达质粒pMT2。回答下列问题。
(1)构建基因表达载体前，需先获取目的基因。PCR技术可用于目的基因的扩增，其原理是_____________________________________________________________。
用PCR技术从基因文库中获取并扩增目的基因时，需要加入人工合成的________作为引物；PCR反应体系中需加入的原料是_______________________________。
(2)若要构建一个穿梭质粒，使其能够在大肠杆菌中大量复制，且能在哺乳动物细胞中表达，质粒上除含启动子、终止子、多个限制酶酶切位点和标记基因外，还需要有________________________________的复制原点。
(3)如图为某种哺乳动物穿梭质粒示意图，现欲使用该质粒表达人生长激素，但人生长激素基因所在的DNA片段上不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有________(填图中的限制酶名称)的切割位点。
(4)将该穿梭质粒、目的基因混合后形成的重组质粒与感受态的大肠杆菌细胞混合，完成转化过程，再从培养的大肠杆菌细胞中提取质粒，可获得大量该质粒。在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中________(填“一定”或“不一定”)含有目的基因，原因是______________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)DNA半保留复制　一小段单链DNA　4种脱氧核苷酸　(2)大肠杆菌和哺乳动物细胞　(3)Nde Ⅰ和BamH Ⅰ　(4)不一定　若大肠杆菌细胞中导入的是未携带目的基因的(穿梭)质粒，大肠杆菌细胞也能在含卡那霉素的培养基中生长(合理即可)
解析　(1)PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA半保留复制。在PCR反应体系中，需加入一小段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；需加入四种脱氧核苷酸作为合成DNA的原料。(2)基因表达载体的组成成分包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。穿梭载体具有两种不同复制原点，要构建一个能够在大肠杆菌中大量复制，且能在哺乳动物细胞中表达的穿梭质粒，需要加入大肠杆菌和哺乳动物细胞的复制原点。(3)如果在哺乳动物的穿梭质粒中插入人生长激素基因，基因表达载体中目的基因的上游为启动子，下游为终止子。题图中启动子和终止子之间有限制酶Nde Ⅰ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列，但是，终止子下游，还有一段限制酶Xba Ⅰ的识别序列，所以，为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的切割位点。(4)导入大肠杆菌细胞的有可能是没有携带目的基因的穿梭质粒，该穿梭质粒上含有卡那霉素抗性基因，导入未携带目的基因的穿梭质粒的大肠杆菌也可在含有卡那霉素的培养基中生长，所以在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中不一定含有目的基因。
微专题3　PCR技术及应用
1.PCR技术原理与条件
2.PCR技术的过程
1.(2021·全国甲卷，38)[生物——选修3：现代生物科技专题]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案　(1)④②③①　(2)热稳定DNA聚合酶(Taq酶)　延伸　两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA模板结合　(3)病原菌DNA　(4)一种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术
解析　(1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的DNA聚合酶是Taq酶，又称热稳定DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步。复性是温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物，这样PCR反应所用的引物会与某种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
2.(2021·1月八省联考湖北卷，24)某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：
Ⅰ.双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5′端和3′端，从左到右的5′—3′DNA链是编码链，从左到右的3′—5′DNA链是模板链。
Ⅱ.增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA3′。
Ⅲ.质粒载体中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ和NotⅠ等酶的酶切位点(这些酶各自的识别序列不同)，如下图所示。
回答下列问题：
(1)增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为
______________________________________________________________________。
(2)通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计________(填“一对”或“一个”)引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95 ℃热变性、55～60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是____________________________和________________________________。
(3)eGFP的PCR产物两端分别含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是_________________________________________________
_________________________________________________________(答一点即可)。
(4)将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个________单菌落。
答案　(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA3′
(2)一对　防止新合成的DNA变性　保证Taq酶所需温度条件
(3)防止目的基因自身环化
(4)发出绿色荧光
解析　(1)基因转录时，以DNA的模板链为模板，按照碱基互补配对原则合成一条mRNA链。由题可知，基因的编码链与模板链配对，又根据mRNA链与模板链配对，可得到增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为5′AUGGUGAGC……AAGUAA3′。(2)由于DNA复制的模板链为两条且DNA聚合酶只能沿5′→3′合成子链，因此利用PCR获得目的基因时，应依据目的基因两端序列设计一对引物。(3)只用一种限制酶切割目的基因和质粒时，由于切出的黏性末端相同，可能会导致目的基因发生自身环化，而双酶切可防止目的基因自身环化。(4)卡那霉素抗性基因为标记基因，用于重组DNA的筛选与鉴定，若表达载体构建成功，则卡那霉素抗性基因会表达，使大肠杆菌具有抗卡那霉素的特性，且目的基因在大肠杆菌中表达，因此可观察到多个发出绿色荧光的单菌落。
3.(2021·南京市学情调研)X基因存在于水稻基因组中，其可在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究X基因表达对卵细胞的影响，设计了如图1所示实验。回答下列问题：
(1)科研工作者从水稻体细胞或精子中提取RNA，构建________文库，进而获得X基因编码蛋白的序列。
(2)为使X基因能在卵细胞中成功表达，需在基因表达载体中插入______________________________________________________________________。
将重组质粒导入水稻愈伤组织细胞，最常用的方法是________________________。
(3)为筛选出含有重组质粒的菌落，需采用含有不同抗生素的平板进行筛选。符合要求的菌落在只含潮霉素、只含卡那霉素、含潮霉素和卡那霉素三种培养基中的生长情况分别为____________(填“生长”或“不生长”)。
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有____________________________；图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒片段中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，则该菌落中含有的质粒________(填“是”或“不是”)正确插入目的基因的重组质粒。
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞在未受精时不能发育，由此表明________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)cDNA　(2)可在水稻卵细胞中启动X基因转录的启动子(和终止子)　农杆菌转化法　(3)不生长、生长、不生长　(4)Taq酶(或耐高温的DNA聚合酶)　甲、乙　不是　(5)X基因在卵细胞中成功表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
解析　(1)从水稻体细胞或精子中提取DNA，构建cDNA文库，进而获得X基因编码蛋白的序列。(2)要使X基因能在卵细胞中成功表达，需要在基因表达载体中插入可在水稻卵细胞中启动X基因转录的启动子(和终止子)，以启动X基因在卵细胞中的转录。将重组质粒导入植物细胞通常使用农杆菌转化法。(3)在构建重组质粒时，X基因插入了潮霉素抗性基因中，潮霉素抗性基因被破坏，其不能正常表达。因此，符合要求的菌落在只含潮霉素的培养基中不能生长，在只含卡那霉素的培养基中能够生长，在含潮霉素和卡那霉素的培养基中也不能生长。(4)PCR反应体系中除了含缓冲液、模板DNA、dNTP、引物外，还应含有Taq酶(即耐高温的DNA聚合酶)。据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应选择的一对引物是甲和乙。某同学从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，则该菌落中含有的质粒不是正确插入目的基因的重组质粒。(5)转基因水稻的卵细胞可以不经受精直接发育成胚，而非转基因水稻的卵细胞在未受精时不能发育成胚，说明X基因在卵细胞中成功表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
专题强化练
(时间：40分钟　满分：100分)
一、微专题强化练
微专题1　细胞工程和胚胎工程
1.(2021·广东湛江期末)科学家利用白菜和紫甘蓝通过植物体细胞杂交技术得到了白菜—甘蓝新品种，下列叙述错误的是(　　)
A.该过程的原理是细胞的全能性和细胞膜的流动性
B.该技术以植物组织培养技术为基础，培养过程需添加一定的植物激素
C.融合的原生质体再生出细胞壁与线粒体、高尔基体、细胞核等细胞器有关
D.获得的白菜—甘蓝是同时具有白菜和紫甘蓝两种植物的遗传物质的新品种
答案　C
解析　植物体细胞杂交过程的原理是细胞的全能性和细胞膜的流动性，其中原生质体融合体现细胞膜的流动性，而杂种细胞培养成植株体现细胞的全能性，A正确；植物体细胞杂交过程以植物组织培养技术为基础，培养过程需添加一定的植物激素，如生长素和细胞分裂素等，B正确；融合的原生质体再生出细胞壁与线粒体、高尔基体等细胞器有关，而细胞核不属于细胞器，C错误；植株由白菜和紫甘蓝两种细胞融合后的杂种细胞发育形成，所以含有两种植物的遗传物质，使得杂种植株可以同时表现白菜和紫甘蓝两种植物的遗传特性，D正确。
2.(2021·河北衡水金卷)如图为动物细胞培养的基本过程，以下叙述错误的是(　　)
A.a中放置的一般是幼龄动物的器官或组织，原因是其细胞分裂能力强
B.将组织用胰蛋白酶或胃蛋白酶处理，制成b瓶中的细胞悬液
C.c、d瓶中的培养液为无菌、无毒的环境
D.培养过程中还需要提供O2和CO2等气体环境，CO2的主要作用是维持培养液的pH
答案　B
解析　a中放置的一般是幼龄动物的器官或组织，原因是其细胞分裂能力强，A正确；将组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成b瓶中的细胞悬液，不能用胃蛋白酶处理，B错误；c、d瓶中的培养液为无菌、无毒的环境，C正确；培养过程中还需要提供O2和CO2等气体环境，CO2的主要作用是维持培养液的pH，D正确。
3.(2021·长春市联考)利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示：
(1)将重组质粒导入受精卵的常用方法是____________，重组质粒的本质是______________________________________________________________________。
(2)过程①后在分子水平上检测目的基因是否导入到受精卵的方法是_____________________________________________________________________。
(3)过程②所用的精子需要达到________状态。过程③胚胎的早期培养中，培养液中除一些无机盐和有机盐类外，还需添加“两素、两酸”以及血清等，其中的“两酸”是指_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)早期胚胎发育到适宜的阶段时，若暂时不移植给受体，可使用________法保存。
(5)在胚胎移植过程中，需要对受体动物进行____________处理，以保证胚胎能够在受体的子宫着床、继续生长发育。受体对外来的胚胎基本不发生____________，这使外来胚胎在其体内存活成为了可能。
答案　(1)显微注射法　双链环状DNA分子　(2)DNA分子杂交技术　(3)获能　氨基酸、核苷酸　(4)冷冻　(5)同期发情　免疫排斥
解析　(1)将重组质粒导入受精卵的常用方法是显微注射法。重组质粒的本质是双链环状DNA分子。(2)在分子水平上检测目的基因是否导入到受精卵的方法是DNA分子杂交技术。(3)获能的精子和成熟后的卵细胞在适宜的环境中才可完成受精。受精后形成的受精卵需经早期胚胎培养，才能进行移植，胚胎的早期培养中，培养液中除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质，其中“两酸”是指氨基酸、核苷酸。(4)早期胚胎发育到适宜的阶段时，可将其向受体移植或冷冻保存。(5)胚胎移植时要对接受胚胎的受体动物进行同期发情处理，以保证胚胎能够在受体的子宫着床、继续生长发育。胚胎在受体内存活的生理学基础是受体对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应。
4.(2021·四川成都七中诊断)已知某RNA病毒包膜表面的S蛋白负责病毒的吸附、融合和侵入宿主细胞，也是诱导宿主产生体液免疫的抗原。针对该病毒的S蛋白研制疫苗和抗体的部分流程如图所示。回答下列问题：
(1)提取该抗原的RNA并将RNA通过________形成DNA。
(2)过程③中，常利用改造后的腺病毒充当载体，改造后的腺病毒能作为载体需具备的条件有___________________________________________________________
_______________________________________________________(答出两点即可)，
构建S蛋白基因重组载体所需的工具酶有____________________。
(3)提取的S蛋白可作为疫苗使用，以病毒包膜表面的S蛋白作为疫苗比开发减毒病毒作为疫苗更为安全，主要原因是______________________________________
______________________________________________________________________。
(4)通过过程⑦获得的X称为________。
答案　(1)逆转录　(2)能自主复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、对宿主细胞无害　限制酶和DNA连接酶　(3)蛋白质不具侵染性，不会破坏细胞结构(合理即可)　(4)杂交瘤细胞
解析　(1)RNA在逆转录酶的作用下可形成DNA。(2)改造后的腺病毒能作为载体需要具备的条件有能自主复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、对宿主细胞无害等。构建重组载体所需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。(3)以病毒包膜表面的S蛋白作为疫苗比开发减毒病毒作为疫苗更安全，主要是因为蛋白质不具侵染性，不会破坏细胞结构。(4)据图分析可知，通过过程⑦获得的X称为杂交瘤细胞。
微专题2　基因工程
5.(2021·山东菏泽期末改编)转基因抗虫棉是我国商业化种植的转基因作物。将Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞可采用农杆菌转化法，下列对相关操作及结果的叙述，错误的是(　　)
A.用相同的限制酶切割Bt抗虫蛋白基因和农杆菌Ti质粒
B.限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成
C.可用PCR技术检测Bt抗虫蛋白基因是否导入成功
D.将Bt抗虫蛋白基因转移至受体细胞的染色体DNA上获得抗虫棉的过程属于染色体变异
答案　D
解析　构建基因表达载体时，用相同的限制酶切割Bt抗虫蛋白基因和农杆菌Ti质粒，以产生相同的末端，便于二者进行连接，A正确；限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成，B正确；可用PCR技术检测目的基因是否导入成功，C正确；将Bt抗虫蛋白基因转移至受体细胞的染色体DNA上获得抗虫棉的过程属于基因重组，D错误。
6.(2021·山东聊城调研)2018年第一例基因编辑的婴儿的诞生，引起中国医学与科研界的普遍震惊与强烈谴责。这一婴儿的基因编辑利用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术，该系统主要包含引导RNA和Cas9内切酶两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9内切酶结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。CRISPR/Cas9系统基因修饰技术流程如图示，请回答下列问题：
(1)Cas9内切酶在自然界原核生物体中的作用是____________________________
_____________________________________________________________________。
(2)图中进行基因修饰过程中，除图中所示工具酶外，还用到____________________，该工具酶________(填“能”或“不能”)特异性识别DNA碱基序列。
(3)将经过修饰的基因组导入斑马鱼、细菌细胞的技术方法分别是________法、Ca2＋处理法等。细菌细胞作为受体的原因是___________________________________。
(4)将经过修饰的基因组成功导入人体细胞后，还需经过_____________________技术，才能获得基因编辑婴儿，但基因编辑婴儿的诞生被世界众多科学家所谴责。若你是一名持谴责态度的科学家，请说明你谴责的理由是____________________
___________________________________________________________(至少两点)。
答案　(1)识别外源性入侵的核酸序列，并对其进行特异性切割
(2)DNA连接酶　不能
(3)显微注射　细菌繁殖快，多为单细胞生物，遗传物质较少
(4)动物细胞培养、早期胚胎培养、胚胎移植　违背人类伦理道德；基因编辑具有一定的不确定性，这给被改编基因的人埋下难以预计的潜在后果；基因编辑后，不能完全达到目的；将基因修饰技术施于人，会导致人类基因的改变(答案合理即可)
解析　(1)Cas9内切酶作为一种限制酶，在自然界原核生物中的作用是切割外源基因，保护自身。(2)基因组靶向修复过程中需要用到DNA连接酶，进行重组DNA分子构建，由于基因工程中用到的DNA连接酶只有两种，而几乎能连接所有的黏性末端或平末端，所以不能特异性识别DNA碱基序列。(3)将经过靶向修饰的基因组导入斑马鱼、细菌细胞的技术方法分别是显微注射技术、Ca2＋处理法，由于微生物细胞作为受体细胞具有细菌繁殖快，多为单细胞生物，遗传物质较少等优点，所以更容易成功。(4)基因导入动物细胞后，还需要经过动物细胞培养、早期胚胎培养、胚胎移植等过程，才能获得转基因动物。如果将基因工程操作应用于人类，可能会违背人类伦理道德；基因编辑具有一定的不确定性，这给被改编基因的人埋下难以预计的潜在后果；基因编辑后，不能完全达到目的；将基因修饰技术施于人，会导致人类基因的改变。
7.(2021·湖南长郡中学联考)采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原(HBsAg)的基因进行质粒构建，将其导入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中，通过培养这种CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单位，从而获得疫苗，基本流程如图所示。请回答下列问题。
(1)要获取HBsAg基因，除采用图中方法外，还可以根据表面抗原蛋白质的结构推测____________________，进而推测目的基因的脱氧核苷酸序列，再进行人工合成。
(2)图中①过程选用的限制酶是________________，理由是_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)利用PCR技术扩增HBsAg基因片段的前提条件是_______________________，以便合成引物。
以下是某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)：
该组引物是否合理？________，理由是____________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(4)若一个HBsAg基因通过PCR扩增了4次，在子代基因中同时含有两个引物的基因占________。
(5)HBsAg基因在CHO细胞中表达需要有特异性的____________________，控制基因表达的起始时间和表达程度。HBsAg基因能否在CHO细胞中稳定遗传的关键是_________________________________________________________________
______________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)氨基酸序列　(2)Hind Ⅲ和Xho Ⅰ　HBsAg基因含有限制酶Hind Ⅲ、Sma Ⅰ和Xho Ⅰ的切割位点，但限制酶Sma Ⅰ的切割位点位于目的基因上，若选用限制酶Sma Ⅰ则会破坏目的基因
(3)要有一段已知目的基因的核苷酸序列　否(不合理)　引物Ⅱ自身折叠后会出现局部碱基互补配对，这影响了与模板的碱基互补配对　(4)7/8　(5)启动子　CHO细胞的染色体DNA上是否插入了HBsAg基因
解析　(1)要获取目的基因，除了采用图中方法外，还可以根据表面抗原蛋白质的结构推测氨基酸序列，进而推测目的基因的脱氧核苷酸序列，再进行人工合成。(2)分析题图可知，含有目的基因(HBsAg基因)的DNA分子中含有限制酶Hind Ⅲ、Sma Ⅰ和Xho Ⅰ的切割位点，但其中限制酶Sma Ⅰ的切割位点位于目的基因上，若选用限制酶Sma Ⅰ则会破坏目的基因，为了保证目的基因的完整性，①过程选用的限制酶是Hind Ⅲ和Xho Ⅰ。(3)利用PCR技术扩增HBsAg基因片段的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。题图中的引物Ⅱ自身折叠后会出现局部碱基互补配对，这影响了与模板的碱基互补配对，所以该组引物不合理。(4)一个目的基因扩增4次后共得到16个子代基因，除了含有模板DNA链的2个基因外，其余的子代基因中都同时含有两个引物，因此在子代基因中同时含有两个引物的基因占7/8。(5)启动子可控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。HBsAg基因能否在CHO细胞中稳定遗传的关键是CHO细胞的染色体DNA上是否插入了HBsAg基因。
微专题3　PCR技术及应用
8.(2021·山东济南调研)PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)DNA复制时子链延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。
(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物________。
5′－GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
图2
引物Ⅰ 引物Ⅱ
甲 5′－GACCTGTGGAAGC A 5′－CATACGGGATTG
乙 5′－CTGGACACCTTCG B 5′－GTATGCCCTAAC
丙 5′－CGAAGGTGTCCAG C 5′－GTTAGGGCTTAC
丁 5′－GCTTCCACAGGTC D 5′－CAATCCCGTATG
(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。
a.按配方准备好各组分。
b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、4种脱氧核糖核苷三磷酸、________、引物、缓冲液等。
c.________使反应液聚集在微量离心管底部。
d.将微量离心管放人PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。
e.进行PCR反应。
(4)PCR的产物片段中，只有________才是符合要求的目标产物。
答案　(1)5′→3′　引物　(2)甲和D　(3)耐高温的DNA聚合酶　离心　(4)双链短产物片段
解析　(1)DNA复制时子链延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核苷酸才能结合上来。(2)引物与DNA的模板链的3′端能够配对，如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最合适的引物为甲和D。(3)PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集在微量离心管底部。(4)DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短产物片段才是符合要求的目标产物。
9.(2021·山东烟台调研)通过RT PCR技术检测咽拭子标本是目前临床上诊断人体是否感染新型冠状病毒的常用方法，用于核酸检测的RT PCR试剂盒的部分工作原理简图如图。回答下列问题：
(1)RT PCR是指以RNA为模板通过________过程合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。进行RT PCR时，需要加入的酶有_________________________
(2)利用PT PCR试剂盒对新型冠状病毒进行检测时，除借助上述RT PCR技术外，还需要有特异性探针。制作该探针的依据是____________________________，利用该探针对新型冠状病毒进行检测的原理是_______________________________。
(3)除核酸检测外，研究人员还研发了基于病毒蛋白的检测技术，该项技术的关键是生产出能与新型冠状病毒结合的特异性抗体。生产该种抗体的大致方案如下：
①向小鼠体内注射新型冠状病毒的抗原蛋白；
②分离免疫小鼠的B淋巴细胞，并与小鼠的骨髓瘤细胞融合，多次筛选、检测，最终获得所需的杂交瘤细胞；
③将获得的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，获得大量的特异性抗体。
上述生产抗体的方案中使用的技术手段有____________________，其中步骤②中获得的杂交瘤细胞具有____________________等特点；步骤③中为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应采取的措施是_____________________________。
答案　(1)逆转录　逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶　(2)新型冠状病毒的(核糖)核苷酸序列　分子杂交
(3)动物细胞培养、动物细胞融合　既能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体　定期更换培养液
解析　(1)以RNA为模板合成cDNA的过程为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的参与，利用PCR技术对cDNA进行扩增时需要耐高温的DNA聚合酶的参与。(2)探针是指被放射性同位素等标记的已知核苷酸序列的核酸片段，其与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循碱基互补配对原则，制作题中探针的依据是新型冠状病毒的(核糖)核苷酸序列。利用该探针对新型冠状病毒进行检测的原理是分子杂交。(3)题中方案制备的是单克隆抗体，采用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合；杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体；步骤③中为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换培养液。

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