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（编号016）
第1讲　基因工程和克隆技术
[明确考纲要求]　1.基因工程：(1)基因工程的诞生(Ⅰ)。(2)基因工程的原理及技术(Ⅱ)。 （3)基因工程的应用(Ⅱ)。(4)蛋白质工程(Ⅰ)。
2.克隆技术：(1)植物的组织培养(Ⅱ)。
(2)动物的细胞培养与体细胞克隆(Ⅰ)。
(3)细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。
核心扫描.基础回归
1.基因工程
(1)一个原理：________________。
(2)一个实验：DNA的粗提取与鉴定实验。
(3)两项技术：________________、________________。
(4)目的基因获取的两条途径：________________________________、人工合成(________________、________________)。
(5)三种工具：________________、________________和________________。
(6)三类转化法：植物——________________、________________、________________；
动物——________________；微生物——________________。
(7)四个操作步骤：①________________，②________________， ③________________，④________________(________________；________________；________________；________________)。
(8)基因表达载体的四个组成：___________、___________、___________、________________。
(9)蛋白质工程“四步曲”：①________________，②________________，③________________，④________________。
(10)质粒载体的五个条件：①________________，②________________，③_______________，
④________________，⑤________________。
五种酶的比较：限制酶________________________________，______________
__________________________________；DNA连接酶 ______________，______________，______________；解旋酶是______________，______________；DNA聚合酶是____________
______________，______________，______________；RNA聚合酶是______________。
小技巧　为避免载体、目的基因的自身环化，往往用两种限制酶切割质粒和目的基因。
2.细胞工程
(1)基本技术
植物细胞工程基本技术：______________技术、______________技术。
动物细胞工程基本技术：______________技术、______________技术、______________技术、______________技术。
(2)细胞融合方法
诱导植物体细胞的原生质体融合的方法：_______、_______、____或用________作为诱导剂。
动物细胞融合常用的诱导方法：______________、______________、______________等。
(3)植物体细胞杂交和动物细胞融合的结果及原理
①植物体细胞杂交
过程：______________，____________________________。
结果：______________，______________。
原理：______________和______________。
②动物细胞融合
过程：用______________处理获得______________细胞，用一定的方法诱导______________，形成______________，再进行______________。
结果：动物细胞融合形成______________，杂种细胞进行细胞培养，获得大量的___________，但没有形成生物体。
原理：______________和______________。
(4)五个注意
①植物体细胞杂交和动物细胞培养都需要____：植物体细胞杂交需要___________________
________________；动物细胞培养需要____________________________________。
②植物组织培养需要____________和____________，动物细胞培养不需要脱分化；植物组织培养的结果是____________或____________(愈伤组织阶段)，动物细胞培养获得的是______或____________。
③植物组织培养用的是____培养基，加入的是____________、_______和________等；动物细胞培养用的是________培养基，加入的是________、________、_____等，还需要________、____________等气体条件。
④动物细胞核移植的受体细胞是________________________ 细胞；单克隆抗体的制备至少需要____次细胞筛选。
⑤生物导弹技术是利用____________的特异性来识别目标，然后将药物与____________进行捆绑，具有定点打击的作用。
网络构建·自我诊断
[关键处填充]
[连接处思考]
1.转基因植物的培育涉及到哪些生物工程？
2.基因工程和克隆技术涉及哪些工具酶？
3.转基因动物的培育涉及到哪些生物工程？
[自我诊断]
1.质粒是常用的基因工程载体。如图是某种天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(标示了部分基因及部分限制酶作用位点)，据图分析下列说法正确的是 (　　)
A.图中的终止子是由三个相邻碱基组成的终止密码
B.用农杆菌转化法可将该质粒构建的表达载体导入动物细胞
C.用限制酶Ⅰ和DNA连接酶改造后的质粒无法被限制酶Ⅱ切割
D.用限制酶Ⅱ处理能防止该质粒构建的表达载体引起植物 疯长
2.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
(1)进行转基因操作前，需用________酶短时间处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。
(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。
(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包括：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、____________和____________。
(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以____________________________，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。
高频考点·命题示例
必考点1　基因工程
1.对基因工程基本工具的思考
(1)限制酶、DNA连接酶、载体的化学本质一样吗？
(2)限制酶和解旋酶有怎样的区别？
(3)DNA连接酶和DNA聚合酶有怎样的区别？
(4)载体具有哪些条件？
2.对基因工程基本操作程序的思考
(1)目的基因的获取途径
① ：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
②人工合成目的基因
常用方法有：a.化学合成法：已知核苷酸序列的 基因，直接利用 用化学方法合成，不需要模板。
b.人工合成法：以 为模板，在 作用下人工合成。
c.利用 技术获得。
(2)基因工程的基本操作步骤中哪几步用到了限制酶，又有哪几步涉及碱基互补配对？
(3)基因表达载体的构建必须用到同一种限制酶吗？
(4)将目的基因导入受体细胞
植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
(5)目的基因的检测与鉴定
①目的基因插入检测： 杂交。
②目的基因转录检测： 杂交。
③目的基因翻译检测： 杂交。
④个体生物学水平检测：根据 判断。
【命题示例1】　下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。
据图回答：
(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用____________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。
(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。
A.启动子 B.tetR C.复制原点 　 D.ampR
(3)过程①可采用的操作方法是________(填字母代号)技术。
A.农杆菌转化 B.大肠杆菌转化 C.显微注射 D.细胞融合
(4)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用________(填字母代号)技术。
A.核酸分子杂交 B.基因序列分析 C.抗原—抗体杂交 D.PCR
归纳总结　基因工程中核心知识归纳
(1)从“基因表达”层面理解基因表达载体的必需元件
①表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
②启动子和终止子：
启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；
终止子是终止转录的位点。
插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前需要有启动子，后需要有终止子。
③基因表达载体的构建过程：
(2)区分一个至多个限制酶切点与每种酶一个切点
①一个至多个限制酶切点：作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
②每种酶一个切点：每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个至多个的酶切点，则切割重组后可能会丢失某些片段。
(3)根据受体种类确定基因工程的受体细胞
受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。
①植物：由于植物细胞有全能性，植物体细胞经过植物组织培养能够形成生物体，所以植物的受体细胞一般是体细胞。
②动物：由于动物细胞没有全能性，不能由一个体细胞培养成一个个体，所以动物基因工程的受体细胞不是体细胞，而是受精卵。
③微生物：多用原核生物细胞，因为原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
【命题示例2】　为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性DNA分子，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验。
已知一线性DNA序列共有5 000 bp(bp为碱基对) 第一步水解 产物(单位：bp) 第二步水解 产物(单位：bp)
A酶切割 3 500 将第一步水解产物分离后，分别用B酶切割 1 5002 000
1 000 1 000
500 500
B酶切割 2 000 将第一步水解产物分离后，分别用A酶切割 5001 500
3 000 2 0001 000
经A酶和B酶同时切割 2 000　1 500　1 000　500
(1)该实验体现出限制酶的作用特点是___________________。
(2)由实验可知，在这段已知序列上A酶和B酶的识别序列分别是________个和________个。
(3)根据表中数据，请在下图中标出相应限制酶的酶切位点。
(4)如图为人的抑癌基因p53的部分区域结构示意图，下列说法错误的是 (　　)
A.与正常人相比，患者的这种变异被称为基因突变
B.正常人的p53基因区域可被限制酶E切割成3个片段
C.杂合体的p53基因区域可被限制酶E切割成4种片段
D.拼接被限制酶E切割的片段需用DNA聚合酶
必考点2　克隆技术
1.比较下表中的动物细胞培养和植物组织培养
项目 动物细胞培养 植物组织培养
前处理 无菌；用 处理，使组织细胞相互分散开 无菌、离体
培养基成分 、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物 等 矿质元素、 、维生素、植物 等
培养基状态 培养基 培养基
过程 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织→ 培养→ 培养→细胞群 离体的植物器官、组织或细胞 →植物体
能否培养成个体
应用举例 大规模生产有重要价值的 ，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等； 移植；检测 等 快速 、培育 植株；生产药物；制造人工种子；培育转基因作物等
特别提醒　(1)两种技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可称为克隆，都不涉及减数分裂；
均为无菌操作，都需要适宜的温度、pH等条件。
2.比较下表中的植物体细胞杂交和动物细胞融合
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合(单克隆抗体的制备)
理论基础(原理)
融合前处理
促融 ①物理法： ；②化学法： ①物化法： ；②生物法：
过程 第一步：原生质体的 ；第二步：原生质体的 ；第三步：杂种细胞的 ；第四步：杂种植株的 第一步：正常小鼠 处理；第二步：动物细胞 ；第三步： 筛选与培养；第四步： 的提纯
用途 克服 的障碍，大大扩展了杂交亲本的组合范围 ①作为 试剂；②用于 疾病和 药物，如“生物导弹”
3.用流程图的形式写出动物体细胞核移植的过程。
【命题示例3】　科学家用植物体细胞杂交方法，将番茄的原生质体和马铃薯的原生质体融合，成功地培育出了“番茄—马铃薯”杂种植株(如图所示)，其中①～⑤表示过程，英文字母表示细胞、组织或植株。据图回答下列问题：
(1)在实现过程②的技术之前使用____________________酶处理细胞以去除细胞壁。
(2)在将杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，依据的原理是__________，其中过程④相当于________过程，过程⑤涉及的分裂方式为__________。
(3)若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞内有n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞内含________条染色体；若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于________倍体植株。
(4)若将该方案用在单克隆抗体制备过程中，请用箭头把下列各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来：________________________。
纠错锦囊　(1)容易混淆的三种细胞辨析——杂种细胞、重组细胞和杂交细胞
①杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去除细胞壁之后形成的原生质体融合，融合的原生质体形成细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。
②重组细胞：体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。
③杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。
(2)从结果来分析原理
①植物体细胞杂交：植物体细胞杂交包含两个过程，一是植物细胞融合，二是杂种细胞的植物组织培养。其最终结果是形成杂种植株，产生了一个生物体，因此其原理是：细胞膜的流动性和细胞的全能性。
②动物细胞融合：动物细胞融合形成杂交细胞，杂交细胞进行细胞培养，获得大量的克隆细胞，但没有形成生物体，因此动物细胞融合的原理是细胞增殖和细胞膜的流动性，不包含细胞全能性。
模拟体验·提升考能
1.下图是某转基因抗虫水稻培育流程简图。下列有关分析错误的是 (　　)
A．该过程涉及基因工程和植物组织培养技术
B．毒蛋白基因在转基因抗虫水稻中的表达需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶
C．可用带荧光标记的毒蛋白抗体检测毒蛋白基因是否在水稻细胞中表达
D．转基因抗虫水稻的种植可能导致昆虫群体抗毒蛋白基因频率增加
2．我国科学工作者培育的转基因抗虫棉，其抗虫基因来源于 (　　)
A．苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因 B．棉铃虫变异形成的致死基因
C．寄生在棉铃虫体内的线虫基因 D．普通棉的突变基因
3．科学家依据基因工程的原理最新研制的某种疫苗是用病原微生物编码抗原的基因制成的，这个基因编码的产物能诱导机体产生免疫反应。该疫苗 (　　)
A．引起人体特异性免疫的原因是DNA分子上具有抗原
B．引起免疫反应后相应淋巴细胞增多，细胞周期将变长
C．能与浆细胞产生的相应抗体发生特异性结合
D．包括抗原基因、启动子、终止子和标记基因等
4．下列叙述不合理的是 (　　)
A．萌发的种子可作为诱变育种的材料 B．植物分生区细胞可用于培育脱毒苗
C．带芽的枝条可提高扦插的成活率 D．乳腺细胞可作为转基因动物的受体细胞
5．下列说法正确的是 (　　)
A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端形成氢键，实现黏性末端的黏合，形成
重组DNA
B．限制性核酸内切酶的切割位点是DNA中磷酸和碱基之间的磷酸二酯键
C．T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端又可以连接双链DNA片段
的平末端
D．用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种
6．某农学院对玉米(2N＝20)的花粉进行离体培养和再生植株的研究(图示如下)，下列有关叙述哪些是不正确的 (　　)
A．图示过程在育种中称为单倍体育种
B．在花粉形成过程中等位基因分离，非同源染色体的非等位基因自由组合
C．对培养基进行灭菌，对花粉进行消毒后才能进行接种和培养
D．花粉离体培养得到的植株有10条染色体，是单倍体
7．关于现代生物技术应用的叙述，错误的是 (　　)
A．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
B．体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
C．植物细胞培养技术可用于植物茎尖脱毒
D．动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育
8．某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你认为有几处是不正确的 (　　)
　　 植物细胞工程 动物细胞工程
技术手段 植物组织培养、植物体细胞杂交 动物细胞培养和融合、单克隆抗体的制备
特殊处理 机械法去除细胞壁 胰蛋白酶处理，制成细胞悬液
融合方法 物理方法、化学方法 物理方法、化学方法、生物方法
典型应用 人工种子、杂种植株 单克隆抗体的制备
培养液区别 生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 动物血清不可缺少
A.1 B．2 C．3 D．4
9．人们应用生物工程技术可以获得所需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
获得抗虫基因的常用方法是______________，利用______________进行大量扩增；而
获取人胰岛素基因还可通过________________法进行人工合成。
利用大肠杆菌生产人胰岛素技术中图⑤所示过程一般要先用____________处理受体
细胞，然后进行细胞转化。人们发现利用大肠杆菌生产的胰岛素活性往往较低，可能的原因是_______________________________________________________________。
利用基因工程生产单克隆抗体时，一般采用________________技术将无限增殖基因导
入________________细胞中，然后进行____________和____________筛选出分泌所需抗体的特定细胞进行扩大培养，进而提取单克隆抗体。
单克隆抗体还可以通过培养由__________________________融合而成的杂交瘤细胞
进行大量制备。
10．下图为利用生物技术获得抗虫棉的过程示意图。据图回答：
在培育转基因植物的过程中，卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡
那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。A过程需要的酶有________________、____________________。C过程的培养基除含有必要的营养物质、琼脂和激素外，还必须加入________________。
离体棉花叶片组织经C、D过程成功地培育出了转基因抗虫植株，此过程涉及的细
胞工程技术是______________，该技术的原理是________________________。
科学家将植物细胞培养到____________，包上人工种皮，制成了神奇的人工种子，
以便更好地大面积推广培养。
如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用___________
_______________作为探针。
已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋
白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种 昆虫危害的能力。
回答下列问题：
为了获得丙中蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙中蛋白
质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。获得丙中蛋白质的基因还可用________、________方法。
(2)在利用上述丙中蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用________酶和____________酶。
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。
12．德国研究人员最近开发出一种新的生产工艺，
利用转基因烟草生产抗艾滋病病毒药物，
这项工艺可以大大降低生产抗艾滋病病毒药物的
成本。植物型抗艾滋病病毒药物的成功开发，对治
疗艾滋病药物的普及具有重要意义。 如图为制备
转基因烟草流程示意图，请回答问题：
(1)构建携带外源基因的质粒时，需要使用的工具酶是_______________________________
_________________________________________。
(2)图中目的基因导入烟草细胞的方法是______________________________________，
除此之外导入植物受体细胞的方法还可以是___________________________________。
将含有目的基因的受体细胞培养成烟草植株的技术叫做_____，其理论基础是
________________________________________________________________________。
（3）在培养过程中，除添加必要的营养物质，还需要向培养基中添加____________，同
时除提供适宜的温度、光照和氧气等环境条件外，成功的关键是________________________________________________________________________。
（4）与该培养过程所用培养基相比，用于动物细胞培养的培养液除含有水分、无机盐、
糖类、维生素以及氨基酸之外，还需要添加________________________。
参考答案 第1讲　基因工程和克隆技术
核心扫描.基础回归
1.基因工程
(1)基因重组。
(3)体外DNA重组技术、转基因技术。
(4)直接从自然界已有的物种中分离、(化学合成法、PCR技术)。
(5)限制酶、DNA连接酶和载体。
(6)农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理。
(7)①获取目的基因，②构建基因表达载体， ③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定(DNA分子杂交；DNA—mRNA分子杂交；抗原—抗体杂交实验；从个体水平鉴定，如抗虫、抗病接种实验)。
(8)启动子、目的基因、终止子、标记基因。
(9)①预期蛋白质的功能，②设计预期蛋白质的结构，③推测应有的氨基酸序列，④找到相应的脱氧核苷酸序列。
(10)①有一至多个酶切位点，②能自我复制，③有标记基因，
④具有安全性，⑤大小合适。
识别双链DNA的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 连接的是两个DNA片段，形成的也是磷酸二酯键，不需要模板
将双链DNA解开，破坏的是氢键 将两个脱氧核苷酸连接起来，形成磷酸二酯键，其需要模板 促进转录过程形成RNA。
2.细胞工程
(1)植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术。
动物细胞培养技术、动物细胞核移植技术、动物细胞融合技术、单克隆抗体技术。
离心、振动、电激或用聚乙二醇作为诱导剂。
聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。
(3)①植物细胞融合，杂种细胞的植物组织培养。
形成杂种植株，产生了一个生物体。
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
②胰蛋白酶 分离的单个动物 细胞融合 杂种细胞 细胞培养。
杂种细胞 克隆细胞
细胞增殖和细胞膜的流动性。
(4)
①酶 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理细胞间质。
②脱分化和再分化 获取植株或细胞代谢产物 细胞或细胞分泌物。
③固体 细胞分裂素、生长素和蔗糖 液体合成 葡萄糖、动物血浆、血清 氧气、二氧化碳
④减数第二次分裂中期的去核的卵母 两
⑤单克隆抗体 单克隆抗体
[关键处填充]
①限制酶 ②载体 ③基因表达载体的构建 ④目的基因的检测与鉴定 ⑤转基因动物 ⑥基因治疗 ⑦基因 ⑧可产生自然界没有的蛋白质 ⑨细胞的全能性、细胞膜的流动性
⑩ 植物体细胞杂交 11 培育作物新品种 12细胞增殖 13动物细胞核的全能性
14获得克隆动物个体 15细胞膜流动性 16给小鼠注射抗原 17产生专一抗体的杂交瘤细胞
[连接处思考]
1.提示　基因工程、植物组织培养。
2.提示　基因工程的工具酶是限制酶和DNA连接酶，克隆技术的工具酶是纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶。
3.提示　基因工程、动物细胞工程、胚胎移植。
[自我诊断]
1.解析　密码子是mRNA上三个相邻的碱基，不会出现在DNA上；农杆菌转化法是将重组载体导入植物细胞；用限制酶Ⅰ和DNA连接酶构建的表达载体中仍存在限制酶Ⅱ的识别位点；用限制酶Ⅱ切割后，编码控制细胞分裂素合成的物质就不能合成了。答案　D
2.解析　(1)为了将动物组织分散并得到单个细胞，可以用胰蛋白(或胶原蛋白)酶处理动物细胞。(2)在基因工程中，构建表达载体时，需要将目的基因插入启动子和终止子之间，以使目的基因得到高效表达。(3)PCR过程模拟的是细胞内DNA分子的复制过程，需要模板、原料、能量、酶(DNA聚合酶)、适宜的温度和酸碱度等，同时需要加入设计好的引物。(4)为了防止发生接触抑制现象而放入小玻璃珠可以增加细胞贴壁生长的附着面积，同时珠内中空，有利于空气交换。
答案　(1)胰蛋白(或胶原蛋白)
(2)启动子　终止子
(3)引物　Taq DNA聚合酶
(4)扩大细胞贴壁生长的附着面积
必考点1
1.(1)答案　不一样。限制酶和DNA连接酶的化学本质是蛋白质，载体的化学本质是核酸。
(2)答案　限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链中特定的位置断开；而解旋酶是将DNA的两条链间的氢键断开，从而形成两条单链。
(3)答案　DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
(4)答案　①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有多个限制酶切割位点；③具有特殊的标记基因。
2.(1)直接分离 较小 DNA合成仪 RNA 逆转录酶 PCR
(2)答案　第一步和第二步用到了限制酶；第一、二、四步涉及碱基互补配对。
(3)答案　不一定。只要切下的末端相同，也可使用不同的限制酶。
(4)农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法(用Ca2＋处理)
受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞
(5)DNA分子 (核酸)分子 抗原—抗体 目的基因表达出的性状
【命题示例1】解析　构建目的基因表达载体必须使目的基因和载体被限制性核酸内切酶同时酶切后露出相同的黏性末端。从图中可以看出，载体无SmaHⅠ酶的切割位点，若要将人乳铁蛋白基因插入载体，就只能选择HindⅢ和BamHⅠ；要选出含有目的基因的大肠杆菌可以通过检测标记基因是否表达来确定，四环素抗性基因中插入了目的基因而失活，故标记基因是氨苄青霉素抗性基因；启动子位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有调控转录的功能；要使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达就必须在重组载体中插入乳腺蛋白基因的启动子；检测蛋白质一般使用抗原—抗体杂交技术。
答案　(1)HindⅢ和BamHⅠ　氨苄青霉素
(3)C (4)C (2)A
【命题示例2】　解析　每一种限制酶都只能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割。根据A酶切割后可得到长度为500的片段，可知在左端或右端500处有一切点，现结合另外两个片段 1 000和3 000能确定两个切点的位置。B酶切出2 000和3 000的片段，应在一端2 000处有切点，现根据同时切割的结果就能判断出B酶切出的3 000被切成1 500、1 000和500三个片段。由图可知C－G变为T－A为基因突变；正常基因被切2次后变成3个片段；杂合体的基因型为Aa，A基因被切成290、170、220三个片断，a基因被切成460、220两个片断，共4种片段；拼接被限制酶E切割的片段用DNA连接酶。
答案　(1)识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割
(2)2　1
(3)如图所示
(4)D
必考点2
1.胰蛋白酶 葡萄糖 血清 蔗糖 激素 液体 固体
原代 传代 愈伤组织 根、芽 不能 能
生物制品 皮肤 有毒物质的毒性 繁殖 无病毒
2.细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性、细胞增殖
酶解法去除细胞壁(纤维素酶、果胶酶等) 注射特定抗原的免疫小鼠，获取B淋巴细胞
离心、振动、电激等 聚乙二醇(PEG) 与促进植物细胞融合的方法相同 灭活的仙台病毒
制备 融合 筛选与培养 诱导与鉴定 免疫 融合 杂交瘤细胞 单克隆抗体
远缘杂交不亲和 诊断 治疗 运载
3.答案　
【命题示例3】　解析　(1)植物体细胞杂交过程中应该用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。(2)杂种细胞培育成为杂种植株依据的原理是细胞的全能性，杂种细胞的组织培养过程要经过脱分化和再分化过程，在植物组织培养过程中只涉及有丝分裂。(3)若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞内有n条染色体，则产生的“番茄—马铃薯”细胞所含的染色体为m＋n条，属于异源四倍体。该杂种植株的花粉经离体培养得到的植株无论含几个染色体组，均为单倍体。(4)制备单克隆抗体的过程包括“正常小鼠处理→融合→筛选→提纯”四步。
答案　(1)纤维素酶和果胶
(2)细胞的全能性　脱分化　有丝分裂
(3)m＋n　单
(4)
模拟体验·提升考能
1．B　2．A　4．D 3．D　5．C　6．A　7．B　8．B
9．(1)从基因文库中获取　PCR技术　反转录(或DNA合成仪)
(2)Ca2＋　原核细胞没有内质网及高尔基体，对蛋白质不能进一步加工　(3)显微注射　浆(或已免疫的B淋巴)　克隆化培养　专一抗体检测　(4)已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞
10．(1)限制性核酸内切酶　DNA连接酶　卡那霉素　(2)植物组织培养　植物细胞的全能性　(3)胚状体　(4)放射性同位素(或荧光分子)标记的抗虫基因
11．(1)基因　化学　基因文库　PCR　(2)限制　DNA连接
(3)乙种昆虫　(4)不含
12．(1)限制酶(限制性核酸内切酶)和DNA连接酶　(2)农杆菌转化法　花粉管通道法和基因枪法　(3)植物组织培养　植物细胞具有全能性　(4)植物激素　无菌操作　(5)动物血清

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