资源简介

(共34张PPT)
发酵工程
—探索发酵工程在生活中的应用
链接高考
课标要求：概念3 发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的产品
3.1获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础
3.1.1阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提
3.1.2阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术
3.1.3举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物
3.1.4概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法
3.1.5概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法
3.2发酵工程为人类提供多样的生物产品
3.2.1举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的
3.22阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品
3.2.3举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
核心素养考察：
理解各菌种用于发酵的原理
分析培养基的成分及作用，比较微生物纯培养两种方法的异同
设计实验探究微生物培养的条件，培养实验探究能力
概述发酵工程，举例说明发酵工程在生产上有重要的应用价值
（2022年山东高考20）. 啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是（ ）
A. 用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B. 焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C. 糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D. 通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
ACD
【学习目标】
1.根据情境材料分析自制啤酒和发酵工程酿制啤酒的异同，归纳传统发酵技术和发酵工程的区别和联系，构建思维导图，厘清发酵工程的发展脉络。
2.构建酵母菌纯培养过程模型，总结微生物的获取、纯培养及计数的一般方法及步骤，说明微生物培养技术是发酵工程发展的基础。
3.举例说明发酵工程在食品工、医药工、农牧业方面的应用。
先创造条件让毛霉生长
再加盐控制毛霉的生长
控制毛霉的生长，
同时增加风味和口感
前期发酵
后期发酵
让豆腐上长出毛霉
加盐腌制
加卤汤装瓶
密封腌制
（一）腐乳制作
流程
制作原理:
蛋白质
蛋白酶
小分子的肽 + 氨基酸
脂肪
脂肪酶
甘油 + 脂肪酸
一.传统发酵技术
食盐的作用：（1）析出豆腐水分 （2）调味
（3）食盐又能防止毛霉继续生长和污染的杂菌繁殖
卤汤中的酒可抑制微生物的生长
（二）制作泡菜
1.菌种：乳酸菌（原核生物） 来源：植物体表面
2. 发酵原理：在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸
3.制作流程及注意事项
C6H12O6 2C3H6O3（乳酸）+能量
酶
质量分数5％--20％；煮沸（除氧；杀灭盐水中其他细菌），冷却待用
八成满（初期酵母菌较活跃，产物有CO2，装满容易使发酵液溢出）
封坛（坛盖边沿水槽中注满水，保证坛内乳酸菌的发酵所需的无氧环境）
腌制条件:
温度不能过高
食盐含量不能过低
腌制时间不能过短
细菌污染大量繁殖后，亚硝酸盐含量增加
腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。
制作泡菜的注意事项
思考：为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？
牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。
认识亚硝酸盐
测定亚硝酸盐的含量
1、测定方法：
比色法
2、测定原理：
在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，反应产物再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。
（三）果酒和果醋的制作
1.制作原理
1、酵母菌：真核、出芽生殖、异养兼性厌氧、28℃
出芽生殖
2、原理：
C6H12O6 →2C2H5OH+2CO2+能量
酶
果酒
果醋
1、醋酸菌：原核、分裂生殖（二分裂）
异养好氧、30-35℃
二分裂生殖
2、原理：
氧气、糖源充足时
酶
C6H12O6+2O2 →2CH3COOH（醋酸）+2H2O+2CO2+能量
氧气充足、糖源不充足时
C2H5OH+O2 →CH3COOH（醋酸）+H2O+能量
酶
醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸
器具消毒 体积分数为70%的酒精消毒
冲洗 先清洗后去除枝梗和腐烂的籽粒，从而避免除去枝梗时，引起葡萄
损坏，增加被杂菌感染的机会。
榨汁装瓶 留大约1/3的空间：①有利于酵母菌有氧呼吸，快速繁殖
②防止产生的CO2使发酵液溢出 ③防止瓶内压强过大导致发酵瓶炸裂
酒精发酵 18-30℃；每隔12h左右将瓶盖拧松一次（排气）此后再拧紧瓶盖
乙酸发酵 30-35℃；打开瓶盖，盖上一层纱布（提供氧气）
2. 制作流程及注意事项
思考：制作果酒时除了酵母菌是否还有其他微生物生长，如果有，如何避免它们对果酒发酵的影响？制作果醋时，酵母菌是否还会持续发酵？
发酵技术 果酒发酵 果醋发酵 腐乳发酵 泡菜发酵
所用菌种 酵母菌 醋酸菌 主要为毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 18～30 ℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
主要生殖方式 出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
主要用途 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
几种传统发酵技术所用菌种比较
（一）、培养基的类型
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理 性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
二、微生物的培养技术
划分标准 培养基种类 特点 用途
化学 成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质（如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基） 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(如查氏培养基) 分类、鉴别
划分标准 培养基种类 特点 用途及几种常见培养基
用途 基础培养基 含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质 牛肉膏蛋白胨培养基
选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长 培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌和霉菌（加入青霉素），培养金黄色葡萄球菌（加入高浓度食盐），以尿素作为唯一氮源，培养分解尿素的细菌，不添加氮源，培养固氮微生物
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌(带有金属光泽的紫黑色菌落)；用酚红指示剂鉴别尿素分解菌（变红）；刚果红培养基鉴别纤维素分解菌（透明圈）
培养基的营养构成
（一）碳源
①无机碳源：
②有机碳源：
CO2、HCO3-等，适于自养生物。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，适于异养生物。
（二）氮源
①无机氮源：
②有机氮源：
N2、NH4＋、NH3、NO3-等，适于固氮微生物
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
（三）无机盐
KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、 FeSO4等。
（四）水
（五）pH、特殊营养物质、氧气等
培养的微生物 需要满足的其他要求
乳酸杆菌 培养基中添加维生素
霉菌 将pH调至酸性
细菌 将pH调至中性或弱碱性
厌氧微生物 需要提供无氧条件
消毒：较为温和理化生方法，杀死物体表面或内部部分微生物
灭菌：强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）
（二）、无菌技术
1.煮沸
100℃煮沸5 ～6min可以杀死微生物细胞和部分芽孢
3.化学药物
酒精擦拭双手；氯气消毒水源；石炭酸、煤酚皂溶液等
2.巴氏消毒法
62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s-1min；
适用于不耐高温的液体，如牛奶、啤酒。
4.紫外线消毒
适用于空气及物体表面
消毒方法
160～170℃、2～3h；适用于耐高温、需保持干燥的物品（吸管、培养皿）和金属用具等
2.干热灭菌
1.湿热灭菌（高压蒸汽灭菌效果最好）
100KPa、121℃、15～30min；适用于培养基灭菌。
注意：①灭菌开始前排净锅内冷空气，否则锅内温度
达不到121℃
②压力降到0时才能打开，否则培养基会冲出锥形瓶，造成污染
灭菌方法
3.灼烧灭菌
在酒精灯火焰充分燃烧层上灼烧，适用于接种环、接种针、接种钩等金属用具以及试管口、三角瓶口灭菌。
三、酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体就是菌落。菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征，是鉴定菌种的重要依据。
纯培养的方法：平板划线法、稀释涂布平板法
（1）配置培养基
马铃薯琼脂培养基:去皮马铃薯200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂15~20g，水1000mL
（2）灭菌
培养基装入锥形瓶，加棉塞（防止污染和挥发），包上牛皮纸扎紧（灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，隔绝空气中杂菌），高压蒸汽灭菌；培养皿5～8套一包，放入干热灭菌箱内灭菌
1.制备培养基
（一）方法步骤
（3）倒平板
培养基冷却至约50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
②瓶口灼烧灭菌
①拔出棉塞
③倒入培养基盖上皿盖
④冷却倒置
（减少水分蒸发；防止形成水滴落到培养基上影响菌落形态）
2.接种和分离酵母菌
对照组：未接种的培养基（用于检验培养基的灭菌是否成功）
平板划线问题讨论
（1）、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
②杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到由单个细菌形成的菌落。
③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
（2）、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
避免接种环温度太高，杀死菌种。
（3）.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
线条末端细菌的数目比线条起始处要少，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
（4）.平板划线时不能划破培养基的原因？
3.培养酵母菌
平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24~28h。
探究学习
1.稀释涂布平板法
（1）稀释涂布平板法的操作步骤是什么？
（2）操作过程中的注意事项有哪些？
2.微生物的数量测定
（1）微生物的数量测定有哪些方法？
（2）为了保证结果更为准确有哪些注意事项？
（3）统计结果是否有误差？
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）选择培养基的配方与一般培养基有什么不同？
（2）如何设置对照组证明培养基的制备是否有杂菌污染以及选择培养基是否具有选择作用？
实验过程设计
2.培养基制备（配制、灭菌、倒平板）
分别制备以尿素为唯一氮源的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基（几乎适应所有微生物）。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
对照组：（1）未接种的选择培养基（用于检验选择培养基的灭菌是否成功）
（2）接种牛肉膏蛋白胨培养基（用于对比证明选择培养基的选择作用）
1.土壤取样（取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具在使用前都要灭菌，铲去表层土）
（二）微生物的选择培养和计数
3.土样稀释（稀释范围选取宽泛1×103~1×107倍，每一次从试管中吸取稀释液前都要充分
摇匀）
4.平板涂布（每个稀释浓度要涂布至少3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基，实验时要对培养皿作好标记，注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。）
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稀释涂布平板法：先将菌液进行系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单菌落，实现菌种的纯培养。
稀释涂布平板法
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
6.菌落计数
稀释涂布平板法：选用菌落数30-300的平板（数值偏小，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到一个菌落）
显微镜直接计数：细菌计数板或血细胞计数板（数值偏大，因为死菌也被计数）
5.微生物培养与观察（每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数目稳定时的记录作为结果）
7.实验结果分析
鉴别：酚红指示剂，变红的是尿素分解菌
刚果红鉴别纤维素分解菌，有透明圈的是纤维素分解菌
每克样品中的菌株数=某一稀释度下平板上生长的平均菌落数目 涂布平板时所用稀释液的体积×稀释倍数
四、发酵工程的基本环节
一般包括：菌种的选育，
扩大培养，
培养基的配制、灭菌，
接种、发酵，
产品的分离、提纯等方面。
发酵工程的基本环节
选育菌种:可以从自然界中筛选,也可通过诱变育种或基因工程获得
扩大培养
发酵罐内发酵:发酵工程的中心环节。在了解发酵进程的同时,还要控制发酵条件。如环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖,而且会影响微生物代谢物的形成
接种
灭菌:不能有杂菌污染。如在青霉素生产过程中如果污染了杂菌,某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉
分离、提纯产物:
(1)若产品是微生物本身,可采用过滤、沉淀等方法;
(2)若产品是代谢物,可根据产物性质采取适当的措施
获得产品
中心环节
电动机
排气管
pH计
冷却水排出口
冷却夹层
发酵液
搅拌叶轮
生物传感器装置
空气入口
放料管
阀门
培养物或营养物质的加入口
观察孔
取样管
温度传感器和控制装置
冷却水进入口
发酵罐内发酵
中心环节
在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。
如谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N -乙酰谷氨酰胺。
发酵罐示意图
各环节需要注意的地方
环节 目的
菌种选育
扩大培养
培养基的配制
灭菌
产品的分离、提纯
性状优良菌种可从自然界筛选，也可通过诱变育种或基因工程育种获得。
工业发酵罐体积大，接种菌种总体积大。发酵前需对菌种扩大培养。
选原料制备培养基。生产实践中，培养基配方要经过反复实验才能确定。
发酵工程所用大多为单一菌种，有杂菌污染影响产量，培养基和设备需严格灭菌
现代发酵工程的大型发酵罐有计算机控制系统，能对温度、PH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养进行监测和控制。还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
发酵工程的中心环节，发酵过程中，要随时检测培养液中微生物数量、产品浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，严格控制温度、PH和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅影响微生物生长繁殖，还影响微生物代谢物的形成。
如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤、沉淀方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可据产物性质采取适当提取、分离纯化措施来获得产品。
接种
发酵罐发酵
啤酒的工业化流程
发芽
焙烤
碾磨
糖化
蒸煮
发酵
主发酵
消毒
终止
后发酵
完成酵母菌的繁殖，大部分糖的分解和代谢物的生成。
主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下 储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。
课前背诵
1.微生物纯培养的两种方法；接种和分离的方法
2.培养基的分类，重点记按照用途划分
3.消毒和灭菌的具体方法及适用对象
4.平板划线法为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
5.微生物数量测定的两种方法 误差及原因

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