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专题二十二 微生物的利用与传统发酵技术
REPORT
考情分析
1.考查内容：本专题内容一直是高考的重点，考查的内容包括传统发酵技术、微生物的培养与应用等。
2.命题规律：已出现的高考试题中，考查内容集中在微生物的实验室培养、特定微生物数量的测定方法、培养基对微生物的选择作用等，试题多为非选择题，试题大都符合高起点、低落点的特点。
3.备考策略
加深知识的果酒、果醋与泡菜的制作、特定微生物的分离纯化等过程模型的相关知识的记忆与理解。
网络构建
考点清单
一、果醋与果酒的制作
1.制作原理和条件
果酒制作 果醋制作
菌种 酵母菌 醋酸菌
原理 无氧呼吸产生酒精 （1）O2、糖源充足：糖→醋酸（2）有O2、缺少糖源：乙醇→乙醛→醋酸
条件 温度 酒精发酵18~25℃ 最适为30~35℃
空气 前期：需氧后期：不需氧 需充足的氧气
时间 10~12d 7-8d
考点清单
2.制作流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵（果酒）→醋酸发酵（果醋）
3.果醋、果酒发酵装置
（1）发酵装置各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的二氧化碳。
③出料口：是用来取样的。
考点清单
④与瓶身相连的长而弯曲的胶管：防止空气中微生物的污染。
（2）该装置的使用方法：使用该装置制果酒出时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵进行充气。
（3）装置分析
①因酵母菌的繁殖需要空气，醋酸菌是好氧菌，所以在果酒制作的前期和果醋制作的整个过程中都需氧。因酵母菌产生酒精是在无氧条件下进行的，故应控制充入氧的量，应在充气口设置开关。
②由于在酒精发酵过程中产生CO2，因此又需设排气口；为防止空气中微生物的污染，排气口应连接一个长而弯曲的胶管。
③因要对发酵的情况进行及时监测，故应设置出料口便于取料。
考点清单
二、腐乳的制作
1.原理
（1）多种微生物（毛霉、曲霉、根霉，酵母菌等）参与豆腐的发酵，其中起主要作用的是毛霉。
（2）毛霉：丝状真菌，是单细胞生物，但细胞中有多个细胞核。毛霉菌丝分为匍匐菌丝和直立菌丝，匍匐菌丝深入到豆腐中吸收营养物质，直立菌丝顶端形成孢子囊，进行孢子生殖（无性生殖）。
（3）微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶将脂肪水解和脂肪酸。在发酵过程中，微生物的生长和繁殖会消耗掉部分有机物和能量，同时产生多种中间产物，所以腐乳与豆腐相比所含热量减少，但有机物种类增加，且小分子有机物更容易被人体吸收。
考点清单
2.流程
让豆腐上长出毛霉：直接接种或利用空气中的毛霉孢子。
↓
加盐腌制：析出豆腐中的水分抑制微生物生长。
↓
加卤汤装瓶：酒：含量12%左右，抑制微生物生长，使腐乳具有独特的香味
香辛料：调味、防腐杀菌。
↓
密封腌制：用酒精灯对瓶口灭菌后密封。
考点清单
三、泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
1.制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
2.步骤
3.操作关键
①泡菜坛的选择选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
②腌制的条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。防止杂菌污染，严格密封。
考点清单
4.泡菜制作的注意事项
（1）材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
（2）防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
（3）氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止泡菜腐烂。
②泡菜坛盖边沿的水槽要注满水，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常向水槽中补充水。
考点清单
（4）温度：发酵过程温度控制在室温即可。温度过高，则易滋生杂菌；温度过低，则发酵时间延长。
5.亚硝酸盐含量的测定
（1）亚硝酸盐的产生：由硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成。
（2）亚硝酸盐的危害：在特定条件下可转变成致癌物亚硝胺。
（3）测定步骤：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。
（4）亚硝酸盐含量测定：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较（比色法），可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
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四、微生物的培养基
1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.营养成分
（1）确定原则：根据微生物的需要。
（2）主要营养物质：碳源、氮源、水和无机盐。
（3）其他条件：pH、特殊营养和氧气
3.种类
考点清单
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产或实验室中微生物的大量培养
半固体培养基 加少量凝固剂 观察微生物的运动、分离、鉴定等
固体培养基 加人凝固剂—琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）；微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落 实验室中微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种等
化学组成 天然培养基 用化学成分不明确的天然物质配制而成 常用于实际工业生产
合成培养基 用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确 常用于微生物的分离、鉴定
目的用途 选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长 筛选目的菌
鉴别培养基 根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的 微生物的鉴别
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4.培养基的制备
（1）步骤：计算一→称量→溶化（→调pH）→灭菌→倒平板。
（2）培养基的配制原则
目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
pH要适宜：培养不同微生物所需pH不同，细菌为6.5-7.5，放线菌为7.5-8.5，真菌为5.0~6.0。
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五、消毒和灭菌
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体（如牛奶）
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的徵生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法 培养基及容器
考点清单
六、纯化大肠杆菌
1.原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
2.两种微生物纯化培养的方法
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线操作实现 将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
考点清单
3.菌种的保藏方法
（1）临时保藏法：对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏
（2）甘油管藏法：对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中混匀后放在-20℃冷冻箱中保存。
七、微生物的选择培养与计数
1.微生物的选择培养
（1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制其他微生物的生长。
（2）实例
①培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌。
②培养基中加入高浓度食盐用于分离金黄色葡萄球菌。
考点清单
③以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离能分解尿素的细菌。
④以纤维素作为唯一碳源的培养基用于分离纤维素分解菌。
⑤以石油作为唯一碳源的培养基用于分离能消除石油污染的微生物
⑥培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。
2.微生物的计数方法
（1）两种计数方法的比较
考点清单
项目 间接计数法（稀释涂布平板法） 直接计数法（显微计数法）
原理 当样品的稀释度足够高时，在培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 1mL样品中的菌落数=（C÷V）×MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数 计数板规格不同，计算公式不同
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计数结果比实际值偏小 不能区分细胞死活，计数结果比实际值偏大
考点清单
（2）用稀释涂布平板法对微生物计数时的注意事项
①需设置对照和重复实验
定白对照：确定培养基制作是否合格，用未接种（或接种无菌水）的培养基与接种菌液的培养基进照。
重复：同一稀释度下至少涂布3个平板。
②菌落数在30-300个的平板计数，且不同平板之间菌落数差异不大，用其平均值作为估算终结果。
3.土壤中分解尿素的细菌的计数
（1）实验原理
①能合成脲酶的细菌才能分解尿素。
考点清单
②配制以尿素为唯一氮源的培养基能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
（2）数量统计
①直接计数法（显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板）。
②间接计数法稀释涂布平板法。
（3）实验流程
土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数
考点1 果醋和果酒制作过程分析
考点通关
甜酒是人们餐桌上常见的一种饮品。与白酒不同，甜酒味道甘甜，酒精度数低，适合的人群更广。家庭制作甜酒的工艺如图所示（酒曲中含有参与发酵的多种微生物）。回答下列问题：
（1）加入酒曲之前，需将蒸熟的原料进行冷却，目的是_____。加入酒曲后进行充分搅拌的主要目的是_____。
（2）酒曲进行发酵的初期是糖化过程，此过程中有些微生物能将原料中的淀粉分解，直接原因是_____。为了确定所取糖化阶段的样品中淀粉是否全部分解，可以加入_____（填“碘液”或“斐林试剂”）进行检测。
（3）在酒精发酵阶段，需要用塑料膜密封容器，这样做的原因是_____。对最终获得的甜酒进行品质分析时，可以借助仪器对酒精度和含糖量进行测定，还可以通过_____（答出两点）进行初步鉴定。
（4）碗里喝剩下的甜酒一段时间后会变酸，在变酸的甜酒表面可以观察到一层白色菌膜的原因是_____。
答案：（1）避免高温杀死酒曲中的微生物；使原料与发酵微生物充分混合，提高发酵效率
（2）这些微生物细胞中能合成淀粉酶；碘液
（3）酒精发酵利用的微生物是酵母菌，其只有在无氧条件下才能进行酒精发酵；观察色泽、嗅味、品尝等（答出两点即可）
（4）甜酒表面氧气浓度较大，醋酸菌会大量繁殖形成菌膜
解析：（1）高温会杀死微生物，故需将蒸熟的原料进行冷却后加入酒曲。加入酒曲后进行充分搅拌可以使原料与发酵微生物充分混合，从而提高发酵效率。
（2）有些微生物能将淀粉分解的直接原因是这些微生物细胞中能合成淀粉酶。淀粉可分解成还原糖，斐林试剂可以检测是否有还原糖产生，但不能检测淀粉是否全部分解，若加入碘液无蓝色形成，可说明淀粉全部分解。
（3）酒精发酵利用的微生物是酵母菌，其只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，所以发酵容器需要密封处理。分析甜酒的品质时，可以借助仪器对甜酒的含糖量和酒精度进行测定，还可以通过观察甜酒的色泽、品尝味道、嗅气味等进行初步鉴定。
（4）碗里喝剩下的甜酒一段时间后会变酸是醋酸菌发酵产生醋酸的结果，因为甜酒的表面氧气浓度较大，醋酸菌会大量繁殖形成菌膜，所以在变酸的甜酒的表面可以观察到一层白色菌膜。
考点2 关于腐乳和泡菜的制作
考点通关
如图所示为家庭制作腐乳的简易流程。回答下列问题：
（1）制作腐乳的原理是______________。
（2）前期发酵阶段，豆腐上的毛霉来自_____________。然而，现代化生产腐乳，需在严格无菌条件下，将_____________直接接种到豆腐上，这样可避免_____________，保证产品的质量。
（3）加盐腌制阶段，“加盐”的正确做法是_____________。
（4）加盐不仅可以析出豆腐中的水分，同时，盐还具有_____________的作用。
（5）后期发酵阶段，向发酵瓶中加入的卤汤是由_____________配制而成的，卤汤中主要成分所起的作用分别是_____________。
答案：（1）毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸
（2）空气中的毛霉孢子；优良毛霉菌种；其他菌种的污染
（3）随着豆腐块层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些
（4）抑制微生物的生长
（5）酒和各种香辛料；酒能抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味；香辛料可调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用（调制风味，防腐杀菌）
解析：（1）腐乳的制作原理是毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
（2）传统的制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免杂菌污染，保证产品的质量。
（3）腐乳制作中“加盐”的操作是随着豆腐块层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
（4）加盐腌制的作用是析出豆腐中的水分，同时还可以抑制微生物的生长。
（5）卤汤是由酒和各种香辛料配制而成的，其中酒能抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味；香辛料可调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。
考点3 微生物的分离和数目测定
考点通关
下表是某种微生物培养基的配方表，请据表回答：
（1）此培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是_____。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必要的操作是_____。
（3）微生物培养最基本的要求是无菌操作，下列对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒方法的正确顺序依次是_____（填序号）。
①化学消毒 ②高压蒸汽灭菌 ③干热灭菌 ④紫外灭菌 ⑤灼烧灭菌 ⑥巴氏消毒法
（4）巴氏消毒法与煮沸消毒法相比，其优点是_____。
（5）用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落数在_____的平板进行计数。若统计出在一稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为30个，所用稀释液的体积为0.2mL，则每毫升样品中的细菌数为_____。
（6）纯化菌株时，通常使用的划线工具是_____。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_____。
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
0.5g 1g 0.5g 2g 200mL
答案：（1）碳源、氮源、生长因子
（2）调节pH
（3）②③⑤①④⑥
（4）在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
（5）30~300；1.5×107
（6）接种环；接种环灼烧后未冷却，划线未从第一区域开始
解析：（1）此培养基的营养成分有五类：碳源、氮源、水、无机盐和生长因子，其中蛋白胨提供的营养物质是碳源、氮源和生长因子。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必须的操作是调节pH。
（3）对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒的方法依次是②高压蒸汽灭菌、③干热灭菌、⑤灼烧灭菌、①化学消毒、④紫外灭菌、⑥巴氏消毒法。
（4）巴氏消毒法主要用于不耐高温的液体的消毒，如牛奶，与煮沸消毒法相比，其优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
（5）用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落在30~300的平板进行计数；根据题意，每毫升样品中的细菌数为30×105÷0.2=1.5×107。
（6）纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环；造成划线无菌落可能的操作失误有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域开始。
考点4 微生物的选择培养与实验设计
考点通关
果胶是一类广泛存在于植物细胞壁，以聚半乳糖醛酸为主的杂多糖，大量存在于柑橘、柠檬、柚子等果皮中。果胶酶是应用于果酒生产的重要酶制剂之一，它广泛存在于细菌、酵母菌等多种微生物细胞中。研究者欲筛选出能大量产生果胶酶的细菌并对其进行计数。回答下列问题：
（1）配制培养基时，培养基通常应该含有水、_____、氮源和无机盐等物质。实验室通常用_____法对培养基进行灭菌。
（2）可从腐烂的柑橘、柠檬、柚子等果皮中进行取样，其原因是这些腐烂的果皮中含有_____。
（3）如表是某同学配制的果胶分解菌的培养基配方（将表中物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL）：
从培养基的物理性质看，该培养基属于_____培养基。这个培养基对果胶分解菌_____（填“具有”或“不具有”）选择作用，原因是_____。
（4）对选择培养的菌液进行一系列梯度稀释，然后采用_____法接种在培养基上进行单菌落分离并计数，推测出菌液样品中活菌数目。
成分 葡萄糖 聚半乳糖醛酸 NaNO3 Na2HPO4·7H2O KCl MgSO4·7H2O 酵母膏 水解酪素
含量（g） 5.0 5.0 1.0 1.2 0.5 0.5 0.5 0.5
答案：（1）碳源；高压蒸汽灭菌
（2）果胶分解菌（或分解果胶的细菌）
（3）液体；不具有；培养基中不应含有葡萄糖，应以聚半乳糖醛酸（果胶）为唯一碳源
（4）（稀释）涂布平板
解析：（1）配制培养基时，培养基通常应该含有水、碳源、氮源和无机盐等物质；实验室通常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。
（2）腐烂的果皮中含有果胶分解菌或分解果胶的细菌，所以可从腐烂的柑橘、柠檬、柚子等果皮中进行取样。
（3）从培养基的物理性质看，该培养基不含有琼脂，属于液体培养基；这个培养基对果胶分解菌不具有选择作用；原因是培养基中含有葡萄糖，以葡萄糖为碳源的众多微生物也可以生长，培养基应当不添加葡萄糖，而以聚半乳糖醛酸（果胶）为唯一碳源，才能筛选出果胶分解菌。
（4）对选择培养的菌液进行一系列梯度稀释，然后采用稀释涂布平板法接种，可以通过单菌落分离并计数，推测出菌液样样品中活菌数目。
一、细胞呼吸方式的判断
物质循环与能量流动模型
传统发酵技术的对比
考法突破
1.与传统发酵技术有关的几类微生物的比较
注意：常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，乳酸杆菌常用于生产酸奶
2.关于传统发酵技术的3个误区
（1）误认为微生物培养基中都需有机碳源、氮源。自养型微生物的培养不需要加有机碳源，固氮菌的培养不需要加氮源。
（2）误认为泡菜制作过程中乳酸的含量是先增加后减少。
泡菜制作过程中乳酸含量是先增加后趋于稳定。
（3）误认为果酒果醋制作过程中都需要无氧条件。果醋制作过程中，利用的是醋酸菌的有氧呼吸，因此需要有氧条件。
微生物 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 异养需氧型 异养厌氧型
适宜温度 18~25℃ 30~35℃ 15~18℃ 室温
主要生殖方式 适宜条件下出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
主要用途 酿酒 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
提升训练
近年来，《舌尖上的中国》引发全民关注美食的热潮，其中不乏利用微生物发酵制作的美食，如腐乳和泡菜等。请回答下列有关问题。
（1）在果酒的自然发酵过程中，参与反应的酵母菌是来自葡萄皮上的野生型酵母菌，在_____________、_____________的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。当氧气和糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌将_____________。
（2）泡菜制作中盐和水的质量比是_____________。泡菜中的亚硝酸盐含量过多会对人体产生危害，通常用_____________法检测亚硝酸盐含量。
（3）腐乳前期发酵时，温度应控制在_____________，并保持一定的湿度；然后向长满毛霉的豆腐块加盐，其作用是_____________，同时，盐还能_____________，避免豆腐块腐败变质。之后要加入配制好的卤汤，其中卤汤中酒的含量应控制在12%左右。酒精含量过高，_____________；酒精含量过低，_____________。
提升训练
答案：（1）缺氧；呈酸性；乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸
（2）1：10；比色
（3）15~18℃；析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；抑制微生物的生长；腐乳成熟的时间将会延长；不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质
解析：（1）在果酒的自然发酵过程中，参与反应的酵母菌是来自葡萄皮上的野生型酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型，无氧呼吸产物有酒精和二氧化碳，二氧化碳溶解于发酵液会使发酵液呈酸性，因此在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。在醋酸发酵过程中，当氧气和糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当氧气充足但缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（2）泡菜制作中盐和水的质量比是1：10。检测泡菜中的亚硝酸盐的含量，通常采用比色法。
（3）腐乳前期发酵时，温度应该控制在15~18℃，并保持一定的湿度。加盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，同时，盐还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。酒精含量一般控制在12%左右，酒精含量过高会延长腐乳成熟的时间，含量过低则不足以抑制杂菌生长，可能导致豆腐腐败变质。专题二十二 微生物的利用与传统发酵技术
考情分析
1.考查内容：本专题内容一直是高考的重点，考查的内容包括传统发酵技术、微生物的培养与应用等。
2.命题规律：已出现的高考试题中，考查内容集中在微生物的实验室培养、特定微生物数量的测定方法、培养基对微生物的选择作用等，试题多为非选择题，试题大都符合高起点、低落点的特点。
3.备考策略
加深知识的果酒、果醋与泡菜的制作、特定微生物的分离纯化等过程模型的相关知识的记忆与理解。
网络构建
考点清单
一、果醋与果酒的制作
1.制作原理和条件
果酒制作 果醋制作
菌种 酵母菌 醋酸菌
原理 无氧呼吸产生酒精 （1）O2、糖源充足：糖→醋酸 （2）有O2、缺少糖源：乙醇→乙醛→醋酸
条件 温度 酒精发酵18~25℃ 最适为30~35℃
空气 前期：需氧 后期：不需氧 需充足的氧气
时间 10~12d 7-8d
2.制作流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵（果酒）→醋酸发酵（果醋）
3.果醋、果酒发酵装置
（1）发酵装置各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的二氧化碳。
③出料口：是用来取样的。
④与瓶身相连的长而弯曲的胶管：防止空气中微生物的污染。
（2）该装置的使用方法：使用该装置制果酒出时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵进行充气。
（3）装置分析
①因酵母菌的繁殖需要空气，醋酸菌是好氧菌，所以在果酒制作的前期和果醋制作的整个过程中都需氧。因酵母菌产生酒精是在无氧条件下进行的，故应控制充入氧的量，应在充气口设置开关。
②由于在酒精发酵过程中产生CO2，因此又需设排气口；为防止空气中微生物的污染，排气口应连接一个长而弯曲的胶管。
③因要对发酵的情况进行及时监测，故应设置出料口便于取料。
二、腐乳的制作
1.原理
（1）多种微生物（毛霉、曲霉、根霉，酵母菌等）参与豆腐的发酵，其中起主要作用的是毛霉。
（2）毛霉：丝状真菌，是单细胞生物，但细胞中有多个细胞核。毛霉菌丝分为匍匐菌丝和直立菌丝，匍匐菌丝深入到豆腐中吸收营养物质，直立菌丝顶端形成孢子囊，进行孢子生殖（无性生殖）。
（3）微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶将脂肪水解和脂肪酸。在发酵过程中，微生物的生长和繁殖会消耗掉部分有机物和能量，同时产生多种中间产物，所以腐乳与豆腐相比所含热量减少，但有机物种类增加，且小分子有机物更容易被人体吸收。
2.流程
让豆腐上长出毛霉：直接接种或利用空气中的毛霉孢子。
↓
加盐腌制：析出豆腐中的水分抑制微生物生长。
↓
加卤汤装瓶：酒：含量12%左右，抑制微生物生长，使腐乳具有独特的香味
香辛料：调味、防腐杀菌。
↓
密封腌制：用酒精灯对瓶口灭菌后密封。
三、泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
1.制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
2.步骤
3.操作关键
①泡菜坛的选择选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
②腌制的条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。防止杂菌污染，严格密封。
4.泡菜制作的注意事项
（1）材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
（2）防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
（3）氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止泡菜腐烂。
②泡菜坛盖边沿的水槽要注满水，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常向水槽中补充水。
（4）温度：发酵过程温度控制在室温即可。温度过高，则易滋生杂菌；温度过低，则发酵时间延长。
5.亚硝酸盐含量的测定
（1）亚硝酸盐的产生：由硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成。
（2）亚硝酸盐的危害：在特定条件下可转变成致癌物亚硝胺。
（3）测定步骤：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。
（4）亚硝酸盐含量测定：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较（比色法），可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
四、微生物的培养基
1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.营养成分
（1）确定原则：根据微生物的需要。
（2）主要营养物质：碳源、氮源、水和无机盐。
（3）其他条件：pH、特殊营养和氧气
3.种类
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产或实验室中微生物的大量培养
半固体培养基 加少量凝固剂 观察微生物的运动、分离、鉴定等
固体培养基 加人凝固剂—琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）；微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落 实验室中微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种等
化学组成 天然培养基 用化学成分不明确的天然物质配制而成 常用于实际工业生产
合成培养基 用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确 常用于微生物的分离、鉴定
目的用途 选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长 筛选目的菌
鉴别培养基 根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的 微生物的鉴别
4.培养基的制备
（1）步骤：计算一→称量→溶化（→调pH）→灭菌→倒平板。
（2）培养基的配制原则
目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
pH要适宜：培养不同微生物所需pH不同，细菌为6.5-7.5，放线菌为7.5-8.5，真菌为5.0~6.0。
五、消毒和灭菌
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体（如牛奶）
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的徵生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法 培养基及容器
六、纯化大肠杆菌
1.原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
2.两种微生物纯化培养的方法
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线操作实现 将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
3.菌种的保藏方法
（1）临时保藏法：对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏
（2）甘油管藏法：对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中混匀后放在-20℃冷冻箱中保存。
七、微生物的选择培养与计数
1.微生物的选择培养
（1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制其他微生物的生长。
（2）实例
①培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌。
②培养基中加入高浓度食盐用于分离金黄色葡萄球菌。
③以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离能分解尿素的细菌。
④以纤维素作为唯一碳源的培养基用于分离纤维素分解菌。
⑤以石油作为唯一碳源的培养基用于分离能消除石油污染的微生物
⑥培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。
2.微生物的计数方法
（1）两种计数方法的比较
项目 间接计数法（稀释涂布平板法） 直接计数法（显微计数法）
原理 当样品的稀释度足够高时，在培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 1mL样品中的菌落数=（C÷V）×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数 计数板规格不同，计算公式不同
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计数结果比实际值偏小 不能区分细胞死活，计数结果比实际值偏大
（2）用稀释涂布平板法对微生物计数时的注意事项
①需设置对照和重复实验
定白对照：确定培养基制作是否合格，用未接种（或接种无菌水）的培养基与接种菌液的培养基进照。
重复：同一稀释度下至少涂布3个平板。
②菌落数在30-300个的平板计数，且不同平板之间菌落数差异不大，用其平均值作为估算终结果。
3.土壤中分解尿素的细菌的计数
（1）实验原理
①能合成脲酶的细菌才能分解尿素。
②配制以尿素为唯一氮源的培养基能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
（2）数量统计
①直接计数法（显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板）。
②间接计数法稀释涂布平板法。
（3）实验流程
土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数
考点通关
考点1 果醋和果酒制作过程分析
甜酒是人们餐桌上常见的一种饮品。与白酒不同，甜酒味道甘甜，酒精度数低，适合的人群更广。家庭制作甜酒的工艺如图所示（酒曲中含有参与发酵的多种微生物）。回答下列问题：
（1）加入酒曲之前，需将蒸熟的原料进行冷却，目的是_____。加入酒曲后进行充分搅拌的主要目的是_____。
（2）酒曲进行发酵的初期是糖化过程，此过程中有些微生物能将原料中的淀粉分解，直接原因是_____。为了确定所取糖化阶段的样品中淀粉是否全部分解，可以加入_____（填“碘液”或“斐林试剂”）进行检测。
（3）在酒精发酵阶段，需要用塑料膜密封容器，这样做的原因是_____。对最终获得的甜酒进行品质分析时，可以借助仪器对酒精度和含糖量进行测定，还可以通过_____（答出两点）进行初步鉴定。
（4）碗里喝剩下的甜酒一段时间后会变酸，在变酸的甜酒表面可以观察到一层白色菌膜的原因是_____。
答案：（1）避免高温杀死酒曲中的微生物；使原料与发酵微生物充分混合，提高发酵效率
（2）这些微生物细胞中能合成淀粉酶；碘液
（3）酒精发酵利用的微生物是酵母菌，其只有在无氧条件下才能进行酒精发酵；观察色泽、嗅味、品尝等（答出两点即可）
（4）甜酒表面氧气浓度较大，醋酸菌会大量繁殖形成菌膜
解析：（1）高温会杀死微生物，故需将蒸熟的原料进行冷却后加入酒曲。加入酒曲后进行充分搅拌可以使原料与发酵微生物充分混合，从而提高发酵效率。
（2）有些微生物能将淀粉分解的直接原因是这些微生物细胞中能合成淀粉酶。淀粉可分解成还原糖，斐林试剂可以检测是否有还原糖产生，但不能检测淀粉是否全部分解，若加入碘液无蓝色形成，可说明淀粉全部分解。
（3）酒精发酵利用的微生物是酵母菌，其只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，所以发酵容器需要密封处理。分析甜酒的品质时，可以借助仪器对甜酒的含糖量和酒精度进行测定，还可以通过观察甜酒的色泽、品尝味道、嗅气味等进行初步鉴定。
（4）碗里喝剩下的甜酒一段时间后会变酸是醋酸菌发酵产生醋酸的结果，因为甜酒的表面氧气浓度较大，醋酸菌会大量繁殖形成菌膜，所以在变酸的甜酒的表面可以观察到一层白色菌膜。
考点2 关于腐乳和泡菜的制作
如图所示为家庭制作腐乳的简易流程。回答下列问题：
（1）制作腐乳的原理是______________。
（2）前期发酵阶段，豆腐上的毛霉来自_____________。然而，现代化生产腐乳，需在严格无菌条件下，将_____________直接接种到豆腐上，这样可避免_____________，保证产品的质量。
（3）加盐腌制阶段，“加盐”的正确做法是_____________。
（4）加盐不仅可以析出豆腐中的水分，同时，盐还具有_____________的作用。
（5）后期发酵阶段，向发酵瓶中加入的卤汤是由_____________配制而成的，卤汤中主要成分所起的作用分别是_____________。
答案：（1）毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸
（2）空气中的毛霉孢子；优良毛霉菌种；其他菌种的污染
（3）随着豆腐块层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些
（4）抑制微生物的生长
（5）酒和各种香辛料；酒能抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味；香辛料可调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用（调制风味，防腐杀菌）
解析：（1）腐乳的制作原理是毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
（2）传统的制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免杂菌污染，保证产品的质量。
（3）腐乳制作中“加盐”的操作是随着豆腐块层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
（4）加盐腌制的作用是析出豆腐中的水分，同时还可以抑制微生物的生长。
（5）卤汤是由酒和各种香辛料配制而成的，其中酒能抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味；香辛料可调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。
考点3 微生物的分离和数目测定
下表是某种微生物培养基的配方表，请据表回答：
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
0.5g 1g 0.5g 2g 200mL
（1）此培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是_____。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必要的操作是_____。
（3）微生物培养最基本的要求是无菌操作，下列对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒方法的正确顺序依次是_____（填序号）。
①化学消毒 ②高压蒸汽灭菌 ③干热灭菌 ④紫外灭菌 ⑤灼烧灭菌 ⑥巴氏消毒法
（4）巴氏消毒法与煮沸消毒法相比，其优点是_____。
（5）用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落数在_____的平板进行计数。若统计出在一稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为30个，所用稀释液的体积为0.2mL，则每毫升样品中的细菌数为_____。
（6）纯化菌株时，通常使用的划线工具是_____。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_____。
答案：（1）碳源、氮源、生长因子
（2）调节pH
（3）②③⑤①④⑥
（4）在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
（5）30~300；1.5×107
（6）接种环；接种环灼烧后未冷却，划线未从第一区域开始
解析：（1）此培养基的营养成分有五类：碳源、氮源、水、无机盐和生长因子，其中蛋白胨提供的营养物质是碳源、氮源和生长因子。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必须的操作是调节pH。
（3）对培养基、培养皿、接种环、双手、空气、牛奶所采用的灭菌消毒的方法依次是②高压蒸汽灭菌、③干热灭菌、⑤灼烧灭菌、①化学消毒、④紫外灭菌、⑥巴氏消毒法。
（4）巴氏消毒法主要用于不耐高温的液体的消毒，如牛奶，与煮沸消毒法相比，其优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
（5）用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落在30~300的平板进行计数；根据题意，每毫升样品中的细菌数为30×105÷0.2=1.5×107。
（6）纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环；造成划线无菌落可能的操作失误有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域开始。
考点4 微生物的选择培养与实验设计
果胶是一类广泛存在于植物细胞壁，以聚半乳糖醛酸为主的杂多糖，大量存在于柑橘、柠檬、柚子等果皮中。果胶酶是应用于果酒生产的重要酶制剂之一，它广泛存在于细菌、酵母菌等多种微生物细胞中。研究者欲筛选出能大量产生果胶酶的细菌并对其进行计数。回答下列问题：
（1）配制培养基时，培养基通常应该含有水、_____、氮源和无机盐等物质。实验室通常用_____法对培养基进行灭菌。
（2）可从腐烂的柑橘、柠檬、柚子等果皮中进行取样，其原因是这些腐烂的果皮中含有_____。
（3）如表是某同学配制的果胶分解菌的培养基配方（将表中物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL）：
成分 葡萄糖 聚半乳糖醛酸 NaNO3 Na2HPO4·7H2O KCl MgSO4·7H2O 酵母膏 水解酪素
含量（g） 5.0 5.0 1.0 1.2 0.5 0.5 0.5 0.5
从培养基的物理性质看，该培养基属于_____培养基。这个培养基对果胶分解菌_____（填“具有”或“不具有”）选择作用，原因是_____。
（4）对选择培养的菌液进行一系列梯度稀释，然后采用_____法接种在培养基上进行单菌落分离并计数，推测出菌液样品中活菌数目。
答案：（1）碳源；高压蒸汽灭菌
（2）果胶分解菌（或分解果胶的细菌）
（3）液体；不具有；培养基中不应含有葡萄糖，应以聚半乳糖醛酸（果胶）为唯一碳源
（4）（稀释）涂布平板
解析：（1）配制培养基时，培养基通常应该含有水、碳源、氮源和无机盐等物质；实验室通常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。
（2）腐烂的果皮中含有果胶分解菌或分解果胶的细菌，所以可从腐烂的柑橘、柠檬、柚子等果皮中进行取样。
（3）从培养基的物理性质看，该培养基不含有琼脂，属于液体培养基；这个培养基对果胶分解菌不具有选择作用；原因是培养基中含有葡萄糖，以葡萄糖为碳源的众多微生物也可以生长，培养基应当不添加葡萄糖，而以聚半乳糖醛酸（果胶）为唯一碳源，才能筛选出果胶分解菌。
（4）对选择培养的菌液进行一系列梯度稀释，然后采用稀释涂布平板法接种，可以通过单菌落分离并计数，推测出菌液样样品中活菌数目。
考法突破
传统发酵技术的对比
1.与传统发酵技术有关的几类微生物的比较
微生物 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 异养需氧型 异养厌氧型
适宜温度 18~25℃ 30~35℃ 15~18℃ 室温
主要生殖方式 适宜条件下出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
主要用途 酿酒 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
注意：常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，乳酸杆菌常用于生产酸奶
2.关于传统发酵技术的3个误区
（1）误认为微生物培养基中都需有机碳源、氮源。自养型微生物的培养不需要加有机碳源，固氮菌的培养不需要加氮源。
（2）误认为泡菜制作过程中乳酸的含量是先增加后减少。
泡菜制作过程中乳酸含量是先增加后趋于稳定。
（3）误认为果酒果醋制作过程中都需要无氧条件。果醋制作过程中，利用的是醋酸菌的有氧呼吸，因此需要有氧条件。
提升训练
近年来，《舌尖上的中国》引发全民关注美食的热潮，其中不乏利用微生物发酵制作的美食，如腐乳和泡菜等。请回答下列有关问题。
（1）在果酒的自然发酵过程中，参与反应的酵母菌是来自葡萄皮上的野生型酵母菌，在_____________、_____________的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。当氧气和糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌将_____________。
（2）泡菜制作中盐和水的质量比是_____________。泡菜中的亚硝酸盐含量过多会对人体产生危害，通常用_____________法检测亚硝酸盐含量。
（3）腐乳前期发酵时，温度应控制在_____________，并保持一定的湿度；然后向长满毛霉的豆腐块加盐，其作用是_____________，同时，盐还能_____________，避免豆腐块腐败变质。之后要加入配制好的卤汤，其中卤汤中酒的含量应控制在12%左右。酒精含量过高，_____________；酒精含量过低，_____________。
答案：（1）缺氧；呈酸性；乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸
（2）1：10；比色
（3）15~18℃；析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；抑制微生物的生长；腐乳成熟的时间将会延长；不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质
解析：（1）在果酒的自然发酵过程中，参与反应的酵母菌是来自葡萄皮上的野生型酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型，无氧呼吸产物有酒精和二氧化碳，二氧化碳溶解于发酵液会使发酵液呈酸性，因此在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。在醋酸发酵过程中，当氧气和糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当氧气充足但缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（2）泡菜制作中盐和水的质量比是1：10。检测泡菜中的亚硝酸盐的含量，通常采用比色法。
（3）腐乳前期发酵时，温度应该控制在15~18℃，并保持一定的湿度。加盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，同时，盐还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。酒精含量一般控制在12%左右，酒精含量过高会延长腐乳成熟的时间，含量过低则不足以抑制杂菌生长，可能导致豆腐腐败变质。
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