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第一章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
新人教版 选择性必修三 生物技术与工程
二 微生物的选择培养和计数
尿素的分子模型
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
那么，如何筛选出人类所需要的微生物呢？
情境导入
筛选原则：：
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家布鲁克从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Taq细菌），进而提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。
美国黄石公园的热泉
情境导入
1.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
冰川冻土层
被石油污染的土壤
热泉
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原则：：
实验实中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长。
1.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基
2.举例：
一、选择培养基
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
③不加碳源的培养基
②不加氮源的培养基
①加入青霉素的培养基
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
一、选择培养基
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
3.选择培养基的设计：
牛肉膏
5.0g
蛋白胨
10.0g
NaCl
5.0g
琼脂
20.0g
蒸馏水
定容到1000ml
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素CO(NH2)2
1.0g
琼脂
15.0g
蒸馏水
定容到1000ml
培养基一
培养基二
讨论：
1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？
都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂。
2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。
3.两种培养基中共有哪些成分？
碳源、氮源、无机盐、水
培养基一的碳源为_______，氮源为_______。
培养基二的碳源为_______，氮源为_______。
牛肉膏，蛋白胨
葡萄糖
尿素
一、选择培养基
牛肉膏，蛋白胨
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4 g
4.0 g
0.5 g
0.5 g
100 mL
【例1】据某微生物培养基的配方表回答下列问题
1.此培养基按物理性质划分属于______培养基，理由是______________________
按功能划分属于_______培养基，因为没有碳源，只有__________微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
2.此培养基含有的微生物的营养成分包括____________________三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括_________________________。
3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是_________________。
4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中 成分(填表中序号)，应加入_________和_______________的有机物。
液体
选择
自养型
水、无机盐、氮源
碳源、氮源、生长因子
凝固剂(琼脂)
①
尿素
不含氮元素
没有凝固剂(琼脂)
习题巩固
一、选择培养基
选择培养基与鉴别培养基的比较
项目
选择培养基
鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而
抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
①培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；
②利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌。
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(菌落呈深紫色)
二、微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌（计数），或想得到分解尿素的细菌的纯培养物（分离），仅有选择培养基是不够的，还必须采用稀释涂布平析法。
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
（1）原理
（2）操作流程
稀释涂布平板法
（2）操作流程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
注意：①取土样时用的铁铲和样品袋在使用前都需要灭菌。
②操作完成后，一定要洗手。
稀释涂布平板法
（2）操作流程
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
稀释涂布平板法
（2）操作流程
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
⑦待涂布的菌液被______________后，将平板_____，放入______________
中培养_______d，在涂布有____________菌液的平板上就可以观察到
分离的_________。
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1~2
合适浓度
单菌落
稀释涂布平板法
（2）操作流程
二、微生物的选择培养
（3）注意事项
①过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行。
②涂布器浸在体积分数为75%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中
滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。不要将过热的涂
布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
③平板划线法能否对细菌进行计数？为什么？
不能
②灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌；
③无法确定接种环上含有蘸取了多少菌液。
①平板划线法最开始的划线菌落会长成一片，
导致无法计数；
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种工具
用途
接种效果图
在固体培养基的表面连续数次划线
①将菌液进行一系列的梯度稀释
②将菌液涂布到固体培养基表面
接种环
涂布器
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
2023/2/24
小结：两种接种方法的比较
统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。原因：_______________
___________________________________________________。
三、微生物的数量测定
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
选择30-300个菌落的平板进行计数；
同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
②计数原则:
③结果分析：
少
细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
当两个或多个
1. 稀释涂布平板法
菌落数≈活菌数
三、微生物的数量测定
1. 稀释涂布平板法
例题1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的活菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A . 2.34×108 B. 2.34×109 C. 2340 D. 234
B
④计算公式：
每g样品中的活菌数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
三、微生物的数量测定
④计算公式：
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例2:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105
=9×107个
1. 稀释涂布平板法
每g样品中的活菌数＝
(C÷V)×M
【例3】 如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是(　　)
A
A.③号试管的稀释倍数为103
B.④号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为⑤号试管的10倍
C.⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109
D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法
①原理：利用特定的_____________或________________在_________下观察、计数，
然后再计算___________的样品中微生物的数量。
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，故统计结果比活菌实际数目 __。
多
②结果分析：
血细胞计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
细菌计数板：
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
优点：
快速、直观
缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
提示：区分死菌和活菌。可采用台盼蓝对细菌进行染色。能被染成蓝色的则为死菌，不能被染色的则是活菌。在此条件下，计数时，只需计数不被染色的酵母菌。
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法
血细胞计数板计数室面积1mm2，液体高度0.1mm，所含液体体积为0.1mm3
计数室
0.1mm
0.1mm3=0.1×10-3cm3=10-4mL
每个小方格平均酵母菌数×400
10-4
×稀释倍数
每毫升原液酵母菌数=
细菌计数板计数室面积1mm2，高度是0.02 mm2，所含液体体积为0.02mm3
每毫升原液细菌数=
每个小方格平均细菌数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
每毫升原液酵母菌数＝每小格平均酵母菌数×400×10000×稀释倍数
每毫升原液细菌数＝每小格平均细菌数×400×50000×稀释倍数
微生物的计数方法比较
内容
直接计数法
（显微镜计法）
间接计数法
(稀释涂布平板法）
计数依据
细菌个数
培养基上菌落数
计算公式
每毫升原液含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
每克样品中的细菌数=(C÷V )×M
C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;
V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);
M:稀释倍数
缺点
不能区分死菌与活菌
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果
比实际值偏大
比实际值偏小
（或50000）
每毫升原液（每克样品）中的细胞数=
稀释液的浓度
×稀释倍数
总结：
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000ml
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
1.培养基的制备
②配方：
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
思考：能用牛肉膏、蛋白胨作为碳源代替葡萄糖吗？
不可以。因含有氮元素。
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去3cm左右的表层土，取样，将样品装入事先准备好的取样纸袋。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
2.实验设计
（1）土壤取样
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以便获得菌落数在30～300之间的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
（2）样品的稀释与稀释涂布平板法接种
可以将稀释范围放宽一点，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考
2.实验设计
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
空白对照组：应接种等量的无菌水
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
（3）微生物的培养与观察
2.实验设计
培养条件：
观察：
结果：
④ 记录：
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}稀释度
104
105
106
107
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}稀释度
104
105
106
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
12
13
14
120
130
140
130
每克土样中分解尿素的细菌的数目=
=1.3ⅹ108
(130/0.1)ⅹ105
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
原理：
3. 初步鉴定
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
D
练习与应用
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
二、拓展应用
1.反刍（chu)动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用
①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养
②创造无氧环境进行培养
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
练习与应用
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
练习与应用
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
练习与应用
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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