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第2节 微生物的培养技术及应用
一 生物的基本培养技术（第1课时）
第1章 发酵工程
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
从社会中来
微生物在固体培养基表面或内部生长，就可以形成肉眼可见的菌落。
沙门氏菌
毛霉
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是 发酵工程的重要基础。
实验室培养微生物的条件:
——培养基
——无菌技术
一、要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
二、要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、根瘤菌、硝化细菌；
放线菌、支原体、衣原体等
微生物：
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
固体
培养基
液体
培养基
+琼脂
分离、计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
根据物理性质划分：
不同菌落的形状、大小、颜色等不同，菌落是鉴定菌种的重要依据。
培养基的类型及用途
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
4、培养基的成分：
牛肉膏
蛋白胨
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
4、培养基的成分：
不加碳源的培养基用来培养 微生物
不加氮源培养基可用来培养 微生物
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
②氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：牛肉膏、蛋白胨是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③无机盐：
NH4＋、 NO2-、 NO3-、 CO32-、HCO3-、Cl- 、Ca2+、K+ 、Mg2+等。
注：有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌、硝化细菌、硫细菌）
自养
固氮
(2)还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
举例说明：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性
培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
4、培养基的成分：
消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
1.概念：
3.方法：
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。适用对象：餐具等生活用品。
②巴氏消毒法：62-65℃下消毒30min 或 80-90℃下处理30s-1min。
适用对象：牛奶、啤酒、果酒等。
③化学药剂消毒法：氯气消毒水源；用70%酒精擦拭双手 (皮肤、伤口、快递包装）
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台30min。
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术主要围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
对操作的空间、操作者的衣着和手行清洁和消毒。
2.适用对象：
4.原理：
煮沸、巴氏消毒：高温导致蛋白质变性。
紫外线消毒：破坏DNA结构，导致微生物死亡。
用酒精消毒时，为什么体积分数为70%--75%的酒精消毒效果较好？
因为酒精的浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固成一层保护膜，使乙醇分子不能渗入其中；酒精浓度过低时酒精的杀菌能力减弱。
用酒精消毒：乙醇导致蛋白质变性。
用氯气消毒：形成次氯酸破坏酶系统，使代谢停止。
消毒
灭菌
1.概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
2.适用对象：
培养细菌用的器皿、接种用具、培养基等进行灭菌。
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
对象：培养基等。
①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅是以水蒸气为介质，内100kPa、121 ℃下维持15-30min
高压蒸汽灭菌锅
3.方法：
湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
3.方法：
湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
原理：使微生物蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温和需要保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 (如试管、培养皿、
吸管、 注射器)金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
3.方法：
湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
③灼烧灭菌：酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具，如涂布器、接种环、接种针、其他金属用具；
接种过程中的试管口、瓶口等易被污染部位。
注意：
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触。为了避免周围环境微生物污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
2、方法： 法和 法。
1、概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微
生物的群体称为培养物；
微生物群
分散
单个微生物
平板划线
稀释涂布平板
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
单个菌落
培养
（菌落）
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物；
获得纯培养物的过程就是纯培养。
3、步骤
（1）制备培养基
配制培养基
灭菌
包器材
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
倒平板
1、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
3、步骤
（1）制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
①可以防止皿盖上的水珠落入培养基，
②可以避免培养基中的水分过快蒸发。
（2）接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
培养
连续划线法
分区划线法
（平板划线）
经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
1
2
3
4
5
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
（2）接种和分离酵母菌
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前对接种环进行灼烧灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
第4区划线
（2）接种和分离酵母菌
分区划线法
灼烧时期 目的
①取菌种前
②每次划线前
③接种结束后
杀死接种环上原有微生物，以免污染培养基。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端。从而通过划线次数的增加，每次划线时菌种的数量逐渐减少，以便得到单个菌落。
杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
实验分析
1. 灼烧接种环的目的:
实验分析
3.为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
如果与第一次划线相连则增加了细胞的数目，达不到纯化的效果。
4、如图所示，接种环共需灼烧几次？
6次
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
（3）培养酵母菌
说明培养基被污染。
可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起。
1.如果在未接种的培养基表面有菌落生长，说明什么？
2.如果在接种酵母菌的增养基上观察到了不同形态的菌落，可能是哪些原因引起的？
结果分析与评价
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
3.使用后的培养基在丢弃前这一定要进行灭菌处理，为什么？
以免污染环境(和操作者）。
细菌：37 ℃
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用（P14）
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
练习与应用（P14）
(1) 这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有______________。
培养皿和培养基
(2) “将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用
什么方法来避免手上微生物的污染？
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
意味着培养液中02含量不同。
练习与应用（P14）
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是
什么
培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌
的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
周末练习
8.某人利用乳酸菌制作泡菜时,因操作不当,泡菜腐烂。下列相关叙述错误的是(　C　)
A.罐口密闭缺氧,有利于乳酸菌的生长繁殖
B.罐口封闭不严,O2抑制了乳酸菌的生长繁殖
C.罐口封闭不严,O2抑制了其他腐生细菌的生长繁殖
D.罐口封闭不严,促进了好氧腐生细菌的生长繁殖
9.果酒和果醋制作过程中,发酵条件的控制至关重要。下列相关措施正确的是(　D　)
A.葡萄汁要装满发酵瓶,造成无氧环境,有利于发酵
B.果酒发酵过程中,每隔12 h左右打开瓶盖一次,放出CO2
C.果酒发酵过程中温度控制在30 ℃,果醋发酵过程中温度控制在20 ℃
D.在果醋发酵过程中,要适时通过充气口充气,以利于醋酸菌的代谢
10.利用果酒制作果醋的原理是(　C　)
A.醋酸菌将乙醇还原为乙酸 B.醋酸菌直接将乙醇氧化为乙酸,不需要其他中间转化过程
C.醋酸菌将乙醇氧化为乙酸 D.醋酸菌将乙醇分解为CO2、水和乙酸
周末练习
5.(18分）图甲是制作果酒、果醋的实验流程示意图,图乙是某同学设计的果酒、果醋的发酵装置。请据图回答下列问题。
(1)图甲中方框内的实验流程是　　　　　　。
(2)冲洗的主要目的是　　　　　　,冲洗应特别注意不能　　　　　　,以防止菌种的流失。
(3)图乙装置中的充气口在　　　　　　发酵时关闭,在　　　　　　发酵时连接充气泵,并适时向内　　　　　　。
(4)排气口在酒精发酵时排出的气体是由　　　　　　产生的　　　　　　,在乙酸发酵时排出的是　　　　　　。
周末练习
16.(12分）回答下列有关泡菜制作的问题。
(1)制作泡菜时,将所用盐水煮沸,其目的是　　　　　　　　　　　　　。
(2)在制作泡菜的过程中,乳酸发酵过程就是乳酸菌进行　　　　　　呼吸的过程。
(3)某同学在家制作泡菜时,发现泡菜坛内长了一层白膜,这层白膜是怎么形成的 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为避免杂菌污染,该同学向泡菜坛中加入了青霉素,结果发酵失败,原因可能是　　　　　　　　　　　　　。
(4)从开始制作到泡菜品质最佳,泡菜液逐渐变酸,这段时间内泡菜坛中的乳酸菌和其他杂菌的消长规律是　　　　　　　　　　　　。
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为____ 　　的物理、化学因素
消灭微生物 的数量 物体表面或内部　　　微生物 物体内外的　　微生物
能否消灭 芽孢、孢子 消灭 芽孢 能消灭 芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作者的衣着和手等 接种环、接种针、
玻璃器皿、培养基等
常用方法
温和
强烈
一部分
所有
比较：消毒与灭菌
部分
全部
煮沸消毒法、巴氏消毒法、
化学药剂消毒法、紫外线消毒法
湿热灭菌、干热灭菌
灼烧灭菌
小结

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