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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序（第2课时）
复习导入：基因工程的基本操作程序
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
含目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且稳定维持和表达，才能实现一种生物的基因在另外一种生物中的转化。
三、将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞
导入受体细胞的方法
受体细胞类型（常用）
①花粉管通道法
②农杆菌转化法（常用）
显微注射法
Ca2＋处理法
（又称感受态细胞法）
受精卵或体细胞
受精卵
原核细胞
1、 花粉管通道法（我国科学家独创）
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入囊胚。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
三、将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
（1）转化：
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
受体细胞
稳定
表达
2、 农杆菌转化法（采用最多）
①能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力
②Ti质粒的T—DNA可转移至被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上
（2）原理：
（3）方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等，
三、将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
（4）过程：
该过程经过____次拼接、____次导入
①第一次拼接：_______________________________
②第二次拼接：_______________________________
_______________________________
③第一次导入：__________________________________
④第二次导入：__________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞
（非人工操作）
拓展
2、 农杆菌转化法（采用最多）
三、将目的基因导入受体细胞
3、 显微注射法
受精卵
注入
将含有目的基因的表达载体提纯
取卵（受精卵）
显微注射
受精卵发育
获得具有新性状的生物
三、将目的基因导入受体细胞
4、 导入微生物细胞
基因工程中，常用原核生物作为受体细胞。
1.繁殖快
2.体积小易于培养操作
3.多为单细胞，遗传物质相对较少
4.经济实用
优点
感受态细胞法（又名Ca2+处理法）
大肠杆菌
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态
Ca2+处理细胞
感受态细胞
重组基因表达载体与感受态细胞混合
常用菌
转化方法
细胞吸收DNA分子
Ca2+：增加细胞壁的通透性
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
当堂巩固
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。（ ）
（2） 构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
当堂巩固
2、（2022春·黑龙江牡丹江·高二牡丹江市第二高级中学校考期末）基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质，下列叙述错误的是（ ）
A．常用相同的限制酶处理目的基因和质粒（载体）
B．DNA连接酶和限制酶是构建重组质粒必需的工具酶
C．重组质粒的构建需在大肠杆菌体内完成
D．将重组质粒导入大肠杆菌细胞用的是感受态细胞法
C
当堂巩固
3、（2022春·陕西·高二陕西师大附中校考期中）在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（　　）
A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B．用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合
D．用Ca2+处理法获得含重组质粒的农杆菌
C
四、目的基因的检测与鉴定
①检测是否插入了目的基因（DNA）
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
分子水平
个体生物学水平
方法：DNA分子杂交、PCR技术
方法：分子杂交、PCR技术
方法：抗原-抗体杂交技术
确定是否具有特性及抗性的程度
（即个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
四、目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传
（2）基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。
可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。
1、检测是否插入了目的基因
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
四、目的基因的检测与鉴定
1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法1：PCR扩增
DNA半保留复制
原理：
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
方法2：DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
四、目的基因的检测与鉴定
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
探针与受体中的mRNA杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已转录
未转录
四、目的基因的检测与鉴定
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理：抗原抗体的特异性结合
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原
转基因生物
四、目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的检测
转Bt基因
非转基因
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功？
四、目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
功能、活性正常
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
小结：基因工程
当堂巩固
4、下列过程中，不需要进行核酸分子杂交的是（ ）
A．利用基因芯片进行疾病诊断
B．检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因
C．检测目的基因是否发生了转录
D．检测目的基因是否翻译成蛋白质
D
当堂巩固
5、（2022春·浙江嘉兴·高二校考期中）下列技术依据碱基互补配对原理的是（ ）。
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
A．①②③④ B．①② C．①②④ D．①②③
B

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