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第一章 发酵工程
第2节
微生物的培养技术及其应用
学科素养：
列举常用的消毒和灭菌方法
简述倒平板和平板画线法的操作过程
1、倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置 （　 　）
2、倒平板时，将打开的皿盖放一边，以免培养基溅到皿盖上（　 　）
3、若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用（ 　　）
4、为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 （ 　 ）
5、平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧 （　 　）
6、培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异 （　 　）
课前六问：
01
选择培养基
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
高温环境（热泉、火山口）
耐高温的酶
耐高温生物体
寻找
寻找
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70-800C高温条件下生存。
实验室微生物如何筛选？
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。
1、选择培养基的概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
2、选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 石油降解菌
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
培养基+氨苄青霉素
培养基
某些细菌
脲酶
产生
尿素分解产生NH3
催化
NH3可以为细菌生长的氮源
1、将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
1.从物理性质来讲，两者属于 培养基，判断依据是 ；该类培养基的主要用途为 。
2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的主要碳源为 ，
主要氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数、保存
培养基二
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红-亚甲蓝培养鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌（若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽）
图示
02
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
（1）概念
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
（2）过程
①梯度稀释菌液
②涂布平板
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落
梯度稀释
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
充分混匀后再稀释
涂布平板
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
1、是否设置空白对照组？如果设置，作用是？
2、涂布平板时，每一浓度梯度的实验组需要涂布几个培养基？
思考与讨论：
设置空白对照，观察培养基是否被污染
至少涂布三个平板，计数时取平均值，减小实验误差
菌落培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
平板划线法
稀释涂布平板法
主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线
接种工具 涂布器 接种环
菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在有显著的菌落特征的区域挑取菌体
能否用于计数 可以计数 不能计数
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征
1、筛选分解尿素的细菌，培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基( )
2、能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶( )
3、稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( )
4、平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数( )
5、可利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌（ ）
6、取土壤和稀释土壤溶液时应在酒精灯火焰旁操作（ ）
03
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
（1）间接计数法
（2）计数原则
①选择30-300个菌落的平板进行计数
②每个稀释度至少取3个平板取其平均值
③考虑重复组结果是否接近，相差太大，意味着操作有误
1、该菌落是由几个微生物繁殖而来？
2、若图中有42个菌落，是由多少个微生物繁殖而来？
稀释涂布平板法
（3）结果分析
①统计的菌落往往比活菌的实际数目低
②统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示
③恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键
稀释涂布平板法
（4）计算公式
每g样品中的菌落数 ＝ (C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
典例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 = 9 ×107个
1、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。
2、一般选择菌落数为 的平板进行计数。
3、在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出
。
4、统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。这是因为_______ _ ___ _______________________________________ _。因此，统计结果一般用 数而不是用活菌数来表示。
一个活菌
菌落
活菌
30～300
平均值
3
菌落
低
当两个或多个
细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
典例：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) （ ）
A.2.34×108
B.2.34×109
C.234
D.23.4
B
显微镜直接计数法
（1）血细胞计数板
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
（2）细菌计数板
对细菌等较小的细胞进行观察和计数
显微镜直接计数法
（3）优点
快速、直观
（4）缺点
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数
③个体小的细菌在显微镜下难以观察
04
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
2、做出假设
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离
3、实验设计
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
4、实验步骤
制备培养基
土壤取样
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
（1）培养基的制备
①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
②制备牛肉膏蛋白胨培养基
对照作用
（2）土壤取样
①取样地：
②取样：
酸碱度接近中性的潮湿土壤中
铲去表层土（一般3cm左右）后再取样
（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层）
注意：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手
（3）样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度。测定土壤中细菌的数量，一般选用1╳104 、 1╳ 105 、 1╳ 106。每个稀释度下需要 个选择培养基。以保证获得菌落数在 、适于计数的平板。
3
30～300
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
整个实验要设置 个空白对照平板：未接种的 培养基，以验证培养基中是否含有杂菌
每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验，遵循 原则），
4为 培养基
4
重复
牛肉膏蛋白胨
平行重复
2
选择培养基、
牛肉膏蛋白胨培养基
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考与讨论：
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
(4)微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取 时的记录作
为结果。防止__________________________________
③结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定
的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
菌落数目稳定
因培养时间不足而导致菌落数目遗漏
稀释度 104 105 106
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 平均值
104
105
106
(5)结果分析与评价
①没有接种的培养基上没有菌落生长
②接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数
③得到了两个或多个菌落数为30～300的平板
培养基没有被杂菌污染
选择培养基筛选出了一些尿素分解菌
稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数
注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈红色
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
在培养基中加入酚红指示剂
—— 鉴别培养基
课堂小结：
微生物的数量测定
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法 - 稀释涂布平板法
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验分析
课后作业：
1、记背相关知识点
2、课时练大本
3、课时练小本

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