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第一章 发酵工程
第2节
微生物的培养技术及其应用
学科素养：
列举常用的消毒和灭菌方法
简述倒平板和平板画线法的操作过程
课前六问：
1、酵母菌通过有氧呼吸可以大量繁殖，无氧呼吸可以产生酒精 ( )
2、各种葡萄都可以酿制出红葡萄酒 ( )
3、由于醋酸菌对氧气的含量相当敏感，所以在醋酸发酵过程中要始终
通入氧气( )
4、只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵 ( )
5、果酒发酵的温度一般控制在30 ℃ ～35 ℃，果醋发酵的温度一般
控制在18 ℃ ～30 ℃( )
6、在利用葡萄发酵生产果酒的后期，加入醋酸菌即可产生乙酸 ( )
01
微生物
微生物：个体无法用肉眼观察的微小生物
实验室培养微生物条件
①提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
②确保其它微生物无法混入
培养基
无菌技术
02
培养基的配置
1、培养基的概念
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质
2、培养基的作用
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
培养皿
培养基
3、培养基的营养成分
①基本成分：碳源、氮源、无机盐、水
②特殊条件：pH、O2和特殊营养物质
碳源
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
自养微生物
异养微生物
氮源
无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
功能：①构成细胞物质和一些代谢产物
②有机碳既是碳源又是能源
功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等
含C、H、O、N的有机物:是异养型微生物的碳源、氮源、能源
无机盐功能：提供无机营养、调剂pH、维持渗透压
水的功能：良好的溶剂、维持生物大分子结构的稳定
例： 1、培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素
2、培养霉菌时，需要将培养基调制酸性
3、培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性
4、培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件
培养基成分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素
NaCI 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成（培养细菌）
蔗糖（C12H22O11） 10g
硝酸钠（NaNO3） 3g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5g
氯化钾（KCl） 0.5g
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 0.01g
琼脂 15～20g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL
查氏培养基成分表（培养霉菌）
4、培养基的类型
按化学组成：天然培养基、合成培养基
按物理性质：液体培养基、固体培养基
按目的用途：选择培养基、鉴别培养基
天然培养基：含化学成分不明确的天然物质
合成培养基：培养基成分明确
培养基成分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素
NaCI 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成（培养细菌）
天然培养基
蔗糖（C12H22O11） 10g
硝酸钠（NaNO3） 3g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5g
氯化钾（KCl） 0.5g
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 0.01g
琼脂 15～20g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL
查氏培养基成分表（培养霉菌）
合成培养基
液体培养基
不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基
固体培养基
含凝固剂（如琼脂）、呈固体状态的培养基；
是实验室最常用培养基之一
扩大微生物种群数量
分离、鉴定、计数和菌种保存等
培养基成分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素
NaCI 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成（培养细菌）
液体培养基
蔗糖（C12H22O11） 10g
硝酸钠（NaNO3） 3g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5g
氯化钾（KCl） 0.5g
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 0.01g
琼脂 15～20g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL
查氏培养基成分表（培养霉菌）
固体培养基
1、用于发酵的微生物主要指细菌和真菌(　 　)
2、培养基中加入琼脂的目的是提供碳源(　 　)
3、所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(　 　)
4、培养不同微生物的培养基成分完全一样(　　 )
课堂练习：
典例：关于微生物的营养，下列说法正确的是（ ）
A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物仅提供无机盐
D.无机氮源也可能提供能量
硝化细菌将NH3氧化为HNO3，化学反应会释放出化学能用于将CO2和H2O合成糖类
D
典例：下列有关培养基的叙述，正确的是（ ）
A.微生物培养都需提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可
B.微生物在固体培养基上生长时，形成肉眼可见的单个细菌
C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性
D.培养基只能培养细菌
C
03
无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是：
防止杂菌污染
消毒
（1）概念
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
（2）消毒对象
操作的空间、操作者的衣着和手
（3）消毒方法
煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒、紫外线消毒
煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min
巴氏消毒法：62-65℃下煮30min或80-90℃下煮30s-1min
化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源
紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
灭菌
（1）概念
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
（2）灭菌对象
用于培养微生物的器皿、接种用具和培养基
（3）灭菌方法
灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌
湿热灭菌
（1）概念
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min
（2）原理
高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
高压蒸汽灭菌锅
（3）优点
操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的芽孢、孢子
（4）对象
培养基等
使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境
干热灭菌
（1）概念
干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气
中维持下2-3h达到灭菌目的
（2）原理
使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
干热灭菌箱
（3）对象
耐高温，需保持干燥的物品
玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器）
金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等）
灼烧灭菌
（1）概念
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
（2）原理
使微生物燃烧
（3）效果
最彻底
灼烧灭菌
（3）对象
接种工具如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，接种过程中的试管口或瓶口等容易被污染的部位
还要注意：
1、避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触
2、为了避免周围环境微生物污染，后续操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰旁进行
1、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染(　　)
2、灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(　　)
3、无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用干热灭菌法进行灭菌(　　)
课堂练习：
连一连：物品所对应的灭菌或消毒方法
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
灼烧灭菌
湿热灭菌
化学药剂消毒
紫外线消毒
干热灭菌
巴氏消毒法
典例：下列有关无菌技术的说法，正确的是（ ）
A.无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物
B.培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌
C.经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期保存
D.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
C
典例：关于消毒、灭菌的方法，下列描述错误的是（ ）
A.接种用的无菌操作台要进行灭菌处理
B.用巴氏消毒法处理牛奶是因为高温易破坏牛奶的营养成分
C.煮沸半小时后的凉开水中可能仍含有部分芽孢和孢子
D.先喷洒消毒液，再用紫外线照射可增强消毒效果
B
04
微生物的纯培养
1、培养物
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的培养
2、纯培养物
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
3、纯培养
获得纯培养物的过程就是纯培养
4、纯培养的过程
配置培养基
灭菌
接种
分离和培养
单个微生物在培养基表面或内部形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落
菌落
一个菌落就是一个种群
菌落：是鉴定菌种的重要依据
细菌
放线菌
霉菌
酵母菌
酵母菌的纯培养
实验原理：
微生物群
分散或稀释
单个微生物
单个菌落
繁殖
如何鉴定哪个菌落是酵母菌？
获得单菌落的方法？
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等
① 平板划线法 ② 稀释涂布平板法
1、制备培养基
（1）制备培养基
（2）灭菌
（3）倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后：平板倒置
在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
思考与探讨：
最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
思考与探讨：
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高；
将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
思考与探讨：
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
2、接种和分离
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
接种：指在无菌条件下将微生物或含菌材料转移到合适其生长繁殖的培养基中的过程。
分离：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
连续划线法
分区划线法
1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次
2.划线首尾不能相接
3.每次划线前灼烧接种环进行灭菌
4.划线操作结束后，仍需灼烧接种环
取菌种前灼烧：
每次划线前灼烧：
接种结束后灼烧：
杀死接种环上原有微生物
杀死上次划线结束后残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
思考与探讨：
以免接种环温度太高，杀死菌种。
在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
思考与探讨：
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
3、酵母菌培养
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-48h。
划3个平板（重复实验）
1个不划线（空白对照）
空白对照无菌落，说明培养基没有污染
4、结果分析与评价
（1）培养基的制作是否合格？
（2）接种操作是否符合无菌要求？
（3）是否进行了及时细致的观察与记录？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
平板划线法可以对菌种进行分离，不能对培养液中菌种进行计数
典例：有关纯化酵母菌实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
C.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
D.划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
A
如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是(　　)
A．①步骤使用的培养基是已经调节过pH并灭菌的培养基
B．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C．③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D．④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
C
课堂小结：
课后作业：
1、记背相关知识点
2、课时练大本
3、课时练小本

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