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(共32张PPT)
1.2.1微生物的培养技术及应用
探讨
近日，山西78岁的马某及其女儿、孙女食用自制臭豆腐后，陆续出现高血压、视力模糊、呕吐等症状，转院治疗，确诊为急性肉毒毒素中毒。后出现多脏器衰竭，住进重症监护室。肉毒素是肉毒杆菌产生的一种外毒素，它不仅是一种嗜神经毒素，而且是已知外毒素中毒性最强的毒素。
专家建议：蛋白质类食品，尤其是豆制品，臭豆腐、酱豆腐、豆豉、纳豆等食品，不建议在家庭进行自制。此类食品在家中操作很难达到无菌条件，更不具备相关的卫生条件。豆制品的致病菌可能致命。
1.为什么不建议自己在家制作发酵产品？
2.怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
自己制作很难达到无菌条件，使用的是混合菌种，容易混入其他有毒的病菌
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
研究和应用微生物的前提
发酵工程的重要基础
一、微生物
1.概念：
2.分类：
3.实验室培养：
无法用肉眼观察的微小生物的统称。
细菌、真菌、病毒以及一些原生生物类。
①提供合适的营养和环境条件；
②确保其他微生物无法混入；
③并将需要的微生物分离出来。
培养基
无菌技术
纯培养
二、培养基
（1）概念：
（2）功能：
（3）种类：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
液体培养基
固体培养基
+凝固剂（如琼脂）
扩大培养、工业生产
分离、计数、鉴定等
半固体培养基：
加少量凝固剂，用于观察微生物运动
二、培养基
（4）菌落：
由单个微生物细胞接种到培养基表面或内层时，当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖形成一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
（固体培养基）
不同菌落的形状、大小、颜色等不同，菌落是鉴定菌种的重要依据
二、培养基
（5）营养组成：
思考：分析教材中“表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析培养微生物的培养基的种类和营养构成。
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
一般都有碳源、氮源、水、无机盐
二、培养基
（5）营养组成：
1.碳源：
（提供碳元素的物质）
无机碳源
有机碳源
CO2、CO32-、HCO3-
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
2.氮源：
（提供氮元素的物质）
无机氮源
有机氮源
N2、NH3、氨盐、硝酸盐
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
一般都有碳源、氮源、水、无机盐
只需要这些物质就足够了吗？
含有C、H、O、N的有机物可以是异养型微生物的碳源、氮源、能源
二、培养基
（5）营养组成：
一般都有碳源、氮源、水、无机盐
其他条件
此外还需要满足微生物生长对_____、______________ 以及_____的需求。
PH
O2
特殊营养物质
例如：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性
培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
主要指生长因子
三、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术主要围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括 和 。
消毒
灭菌
思考2：结合教材中有关无菌技术的内容，说出消毒和灭菌的原理、主要方法和所需要的设备，比较两者对微生物作用效果的差异。
比较项目 作用强度 杀死微生物的范围 能否杀死芽孢和孢子
消毒
灭菌
较为温和
比较强烈
物体表面或内部一部分微生物
体内外所有微生物
能
否
补充：芽孢和孢子
芽孢：内生孢子，是细菌休眠体。营养条件缺乏时，细菌在菌体内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等。
孢子：某些生物的繁殖体，有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。
三、无菌技术
1.消毒方法
①煮沸消毒法：
②巴氏消毒法：
③化学药剂消毒法：
④紫外线消毒法：
100℃煮沸5-6min。适用对象：餐具等生活用品。
62-65℃下消毒30min或 80-90℃下处理30s-1min。
适用对象：牛奶、啤酒、果酒等
氯气消毒水源；用70%酒精擦拭双手 (皮肤、伤口、快递包装）
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台30min。
适用对象：对操作的空间、操作者的衣着和手行清洁和消毒。
三、无菌技术
2.灭菌方法：
①湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。高压蒸汽灭菌的效果最好，100 kPa、121℃下维持15~30 min，常用于培养基、无菌水等的灭菌。
三、无菌技术
2.灭菌方法：
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
对象：耐高温和需要保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 (如试管、培养皿、 吸管、 注射器)金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
三、无菌技术
2.灭菌方法：
③灼烧灭菌：酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧（最彻底）
对象：接种工具，如涂布器、接种环、接种针、其他金属用具；接种过程中的试管口、瓶口等易被污染部位。
1.下列有关以CO2为唯一碳源的自养微生物所需营养物质的描述中,错误的是
A.铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮元素
B.碳源物质也是该微生物的能源物质
C.水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质
D.琼脂不是该微生物的营养要素之一
B
2.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法分别是
①化学消毒法　②灼烧灭菌　③干热灭菌 ④紫外线消毒法　⑤湿热灭菌　⑥巴氏消毒法
A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
A
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触。为了避免周围环境微生物污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
四、微生物的纯培养技术
（1）相关概念：
1.培养物：
2.纯培养物：
3.纯培养：
4.步骤：
在微生物学中，接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
获得纯培养物的过程就是纯培养
菌落
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
配制培养基→
灭菌→
接种→
分离→
培养
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
1.实验原理：
2.材料用具：
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
获得单菌落的方法：稀释涂布平板法、平板划线法
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤
制备培养基
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
配制培养基
灭菌
倒平板
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤——制备培养基
配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
牛皮纸：灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用。
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤——制备培养基
倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
温度过高易烫伤，过低培养基会凝固。
将瓶口迅速通过火焰
灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
冷凝后平板倒置
防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染。
避免周围环境中微生物的污染
思考：
1.如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前还是灭菌之后进行操作？
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
3.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
4.所以在接种之前，我们如何检测培养基是否被污染？
灭菌前
最好不要用这个平板培养微生物，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
如果有菌落，说明培养基被污染，不能进行后续接种实验
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在。目的：确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。（无菌检查）
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤——接种和分离菌种
接种方法
平板划线法
稀释涂布平板法
斜面接种
穿刺接种
最常用的接种方法
分离：
微生物群
单个细胞
单个菌落
分散/稀释
繁殖
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤——接种和分离菌种
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
连续划线法
分区划线法
①
②
③
④
⑤
请大家阅读课本P13中平板划线的步骤，分析平板划线有注意的事项有哪些？
最终目的
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
思考分析：
1.总共蘸取了几次菌液？
2.为什么要多次灼烧接种环？
1次
灼烧时期 目的
①取菌种前
②每次划线前
③接种结束后
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端。从而通过划线次数的增加，每次划线时菌种的数量逐渐减少，以便得到单个菌落。
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
思考分析：
3.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
4.在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
5.为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
6.你觉得要接种多少个平板才合适？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端。从而通过划线次数的增加，每次划线时菌种的数量逐渐减少，以便得到单个菌落
如果与第一次划线相连则增加了细胞的数目，达不到纯化的效果。
3个平板（重复实验）
四、微生物的纯培养技术
（2）酵母菌的纯培养：
3.步骤——培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
空白对照：检验培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
思考：若在接种的培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是什么？
菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
实践应用：通过本节课的学习，请你思考生活中保存食品的方式有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物的生长的？
干制：降低食品含水量；
腌制：通过盐、糖等高渗环境，抑制微生物生长和繁殖；
低温：降低微生物的代谢，抑制微生物生长和繁殖。
谢谢观看

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