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1.2 微生物的培养技术及应用（第3课时）
教学目标
1.概述培养基的营养构成和种类
2.概述无菌技术的原理和方法，掌握无菌操作
3.通过配制培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基，初步掌握配制培养基的基本技能
4.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法
5.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法
二 微生物的选择培养和计数
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
2.如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
那什么是选择培养基呢？
1.选择培养基
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
耐热微生物
耐寒微生物
石油分解菌
二 微生物的选择培养和计数
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
常见的选择培养基
1.选择培养基
二 微生物的选择培养和计数
选择培养基配方的设计
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO-、NH4＋等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
CO(NH2)
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
NO-、NH4＋
被植物吸收
尿素分子模型
1.选择培养基
二 微生物的选择培养和计数
1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
思考·讨论
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
尿素分子模型
1.选择培养基
二 微生物的选择培养和计数
选择培养基配方的设计
培养基②
培养基①
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2%。
培养基的主要用途是分离、鉴定、计数。
1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？
3.两种培养基中共有哪些成分？哪些作为碳源、氮源？
培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。
碳源、氮源、无机盐、水；
培养基①的碳源为牛肉膏，氮源为蛋白胨；培养基②的碳源为葡萄糖，氮源为尿素；
二 微生物的选择培养和计数
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌
原理：通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
稀释涂布平板法
梯度稀释和涂布平板
平板划线法
（上节已讲）
仅有选择培养基可以了吗？
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1×107
1×106
1×105
1×104
1×103
1×102
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
②在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法的操作过程
微量移液枪
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
①各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，梯度稀释时，试管口和移液管在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
几点注意事项
②将涂布器浸在盛有质量分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。
③操作中要注意防火。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
④涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
培养与观察：
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。
恒温培养箱
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
3.微生物的数量测定
平板划线法
稀释涂布平板法
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平法发可以用于细菌的计数？如何计数？
3.微生物的数量测定
二 微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法计数的原理:
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为什么统计的菌落数往往比活菌的实际数目小？
这是因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。
对细菌进行计数
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
为了保证结果准确，一般选择菌落为30-300的平板进行计数。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
减少实验误差,保证实验结果更准确
平板划线法
用平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的吗？为什么？
×
2.微生物的选择培养
二 微生物的选择培养和计数
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。因此计数的结果比实际值大。
（1）显微镜直接计数法
较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
3.微生物的数量测定
二 微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定方法：
显微镜直接计数法
稀释涂布平板法
①分离微生物
②用来统计样品中活菌的数目
3.微生物的数量测定
二 微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）稀释涂布平板法
二 微生物的选择培养和计数
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；
M代表稀释倍数。
例.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) （ ）
A.2.34×108 B.2.34×109 C.234 D.23.4
B
（2）稀释涂布平板法
二 微生物的选择培养和计数
3.微生物的数量测定
计数：
①选择30-300个菌落的平板进行计数；
②每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
④统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
⑤恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
需要设置对照实验吗 若需要，目的是？
（2）稀释涂布平板法
二 微生物的选择培养和计数
3.微生物的数量测定
换算为一个大方格（0.lmm ）稀释液中的菌株数
显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、血细胞计数板 培养基
计数依据 菌株本身 培养基上的菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌活菌都计算在内 操作复杂，有一定误差
计算公式 1ml原液含菌株数=每小格平均菌株数*400*10*1000*稀释倍数 lml原液含菌株数=平均菌落数/涂布平板所用稀释液体积（（ml） x稀释倍数
直接计数与稀释涂布平板法的比较
换算 1mm3稀释液中的菌株数
换算 1ml稀释液中的菌株数
换算 1ml原液中的菌株数
二 微生物的选择培养和计数
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的_________，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
平板 示图
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 连续划线
梯度稀释
两种纯化方法的比较
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
小结
即时练习
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。
√
√
√
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是
A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
二、拓展应用
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
即时练习
(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。( )
(2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。( )
(3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( )
(4)平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数( )
(5)可利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌（ ）
(6)取土壤和稀释土壤溶液时应在酒精灯火焰旁操作（ ）
×
√
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×
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三、基础过关
即时练习
学而时习之

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