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(共25张PPT)
1.2 微生物的培养技术及应用（第4课时）
教学目标
1.概述培养基的营养构成和种类
2.概述无菌技术的原理和方法，掌握无菌操作
3.通过配制培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基，初步掌握配制培养基的基本技能
4.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法
5.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法
1.提出问题
(1)土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
(2)每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以尿素作为唯一碳源的选择培养基，可以分离。
自变量：________________________
因变量：__________________________
无关变量：______________________________
尿素
能分解尿素细菌的生长情况
培养时间、培养基的pH、温度等
2.做出假设
3.实验设计
实验思路
预测实验
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
【实验目的】
1.土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何和分离它们？
2.每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
探究.实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【实验原理】
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方如下。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4 7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
①提供无机盐；
②调节pH。
提供碳源
提供氮源
提供水
可判断为固体培养基
【实验设计流程】
土壤取样
①要求：富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤
②取样土层：距地表3~8cm的土壤层
制备培养基
以尿素为唯一氮源（选择培养基）
样品的稀释
在酒精灯火焰旁称取土壤10g，放入90mL无菌水的锥形瓶中，震荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吸取三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。以此类推，制成103、104、105、106、107倍的土壤稀释液。
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
注意：样品的稀释与稀释涂布平板法接种
探究.实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
涂布平板
培养与观察
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基以验证培养基中是否含有杂菌。
1
2
3
4
将平板倒置于30~37℃的恒温培养箱中培养1~2天。每隔24小时统计一次菌落数目
【实验设计流程】
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
【实验设计流程】
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 平均值
104
105
106
【实验设计流程】
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
【结果分析与评价】
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 空白对照的培养基中无菌落生长
培养基中菌落数偏高
菌落形态多样，菌落数偏高
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板
重复组的结果 未被杂菌污染
被杂菌污染
混入其他氮源
选择培养基具有筛选作用
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应相近
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
【原理】脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
【进一步探究】
探究 实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红-亚甲蓝琼脂培养基
淀粉培养基
尿路菌群显色培养基
念珠菌群显色培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 添加（或缺少）某种化学成分 加入某种指示剂或化学药品（不影响微生物正常生长）
机理 抑制其他微生物生长，促进目标微生物的生长 微生物的某种代谢物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，使目标菌落出现特定的特征
平板的 菌落 只出现目标菌落 出现多种菌落，但目标菌落出现特定的特征
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别出目标微生物
选择培养基和鉴别培养基的区别
按用途分
小结
特性 主要用途 设计原理
加入青霉素 分离酵母菌等真菌 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
不加氮源 分离固氮微生物 固氮微生物能利用空气中的氮气
不加碳源 分离自养型微生物 自养型微生物能利用无机碳源
几种选择培养基的设计
小结
几种常用的鉴别培养基
名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化
伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈
油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色
淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈
H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀
小结
小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
即时练习
√
√
√
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
即时练习
二、拓展应用
1. 反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
即时练习
2. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
即时练习
二、拓展应用
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请 你给出详细的实验方案。
土壤取样
→富含纤维素的环境
→以纤维束为唯一碳源，增加目的菌浓度
（选择培养基）
→制备系列稀释液
→筛选产生透明圈的菌落
→将样品涂布到含刚果红的培养基上
（鉴别培养基）
梯度稀释
选择培养
涂布平板
挑选
即时练习
二、拓展应用
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
即时练习
二、拓展应用
（3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
即时练习
学而时习之

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