资源简介

(共70张PPT)
2017年1月10日，中华人民共和国农业部正式批准对“雁荡山铁皮石斛”实施农产品地理标志登记保护。
2019年11月15日，雁荡山铁皮石斛入选中国农业品牌目录。
铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物。作为我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值。由于长期过度采挖,加之本身繁殖率低,导致其野生资源急剧减少，日趋濒危。近年来，对铁皮石斛的需求日趋增加，而野生资源难以满足市场需求。
植物克隆
如何快速得到大量的铁皮石斛植株？
植物细胞工程产品
1.分子水平基因克隆
指通过重组DNA技术插入某载体的特定DNA片段，在宿主细胞中进行多次复制而形成的分子群体。
2.细胞水平的克隆
指由一个细胞分裂形成的一个细胞群体。产生特异性抗体的所有浆细胞是由一个B细胞分裂形成的的一个细胞群体。
3.个体水平
指通过无性繁殖而得到的基因型相同的个体组成的群体。
克隆：用幼苗或嫩枝以营养繁殖方式培育植物。
小资料
科技探究之路细胞工程的发展历程
1907年哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1958年斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1998年汤姆森和吉尔哈特获得可体外培养的人胚胎干细胞
2006年山中伸弥获得诱导多能干细胞
1975年米尔斯坦和科勒获得能稳定遗传的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
1971年卡森诱导烟草原生质体融合，培育出第一株体细胞杂交植物
1960年科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1996年世界上第一只体细胞克隆羊多莉诞生，随后多种克隆动物相继问世。
2017年我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
原材料
产物
加工
分类①
分类②
2.1 通过植物组织培养可获得完整植株
理论基础/原理：
植物细胞的全能性
根本原因？
细胞全能性实例：
——多肉进行叶插繁殖
1.选取多肉上健康、饱满的叶片。
2.用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3.平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4.叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5.待叶片晾干后移至半阴处养护。
6.约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7.叶插成功
一、植物的全能性使离体组织发育成完整植株成为可能
1.概念：
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体的潜能
2.根本原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质
3.全能性低/不体现的原因：
基因在特定时间、空间条件下选择性表达
（一）植物细胞的全能性
全能性大小比较
①受精卵、体细胞、胚胎干细胞、生殖细胞
②植物细胞、动物细胞。
①受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞>体细胞；
②植物细胞>动物细胞。
细胞分化程度提高,细胞全能性降低
根韧皮部单细胞
植物组织培养的取材？
细胞工程：是按照一定的设计方案，借助工程学的方法或技 术，以生物组织、细胞和细胞器为对象进行操作，在细胞水平上改造生物遗传特性，以获得（目的）特定的细胞产物、细胞、组织、器官或新生物体的技术。
类型：按技术类型可分为细胞和组织培养、细胞融合、核移植技术等；
按生物类型可分为植物细胞工程和动物细胞工程等。
动物细胞工程的基础技术：动物细胞培养
植物细胞工程的基础技术：植物组织培养
（二）植物组织培养技术
1.概念：
3.分类：
在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织或细胞等培养在人工配制的培养基上，使其生成完整植株或使其细胞增殖并产生细胞代谢产物的技术。
2.理论基础：
细胞的全能性
依据外植体的不同，分为器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养
条件①
条件②
条件③
材料/对象
产品
离体培养
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
4.一般过程：
外植体
旧识知多少：植物组织培养流程？
以铁皮石斛茎段为外植体，结合课本内容，
设计铁皮石斛组织培养技术路线框架图。
要求 ：用简要的流程图（用关键字词和箭头）表示植物克隆的途径。
学生活动：
愈伤组织的细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的无定形状态的细胞。愈伤组织形成以后，如果在原来的培养基上续培养，就会由于培养基中养分不足或有毒代谢产物的，导致愈伤组织生长停止，甚至老化变黑乃至死亡。如果要愈伤组织续生长增殖，必须定期地将它们分成小，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的再分化主要有两种方式。一种是不定芽方式，就是在某些条件下，愈伤组织的细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。另一种是胚状体方式，就是由愈伤组织诱导分化出的具有胚芽、 胚根、胚轴的类似于胚的结构。能够产生胚状体的愈伤组织常见于胡萝卜、芦笋、玉米和小麦等植物。
小贴士
4.基本过程
失去特有结构和功能转变成未分化有分裂能力的细胞
外植体（茎段）
愈伤组织
再生幼苗
脱分化
再分化
铁皮石斛
愈伤组织重新分化为各类细胞，进而形成芽、根等器官
无组织结构、松散的薄壁细胞团
猜想：是否整个过程均需要光照？
遮光
光照
培养条件：
①无菌
②营养物质
③适宜环境条件（温度、PH、光等）
④植物激素：
细胞分裂素 生长素
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
植物进行有性生殖时，亲本产生的精子和卵细胞结合形成合子（受精卵）。在种子形成过程中，合子经细胞分裂、分化，从球形胚、心形胚、鱼雷胚到成熟胚，由合子发育成的胚称为合子胚。在种子萌发过程中，合子胚发育成完整的植株。有性生殖增加了后代的变异性。
体细胞胚虽经历了与合子胚相似的发育过程，但其来源不是合子。体细胞胚可由体细胞分裂分化而来，也可由生殖细胞不受精（如花粉细胞）直接分裂、分化而来；可由外植体经愈伤组织再分化产生，也可不经愈伤组织阶段直接在外植体上发生。
合子胚
体细胞胚
体细胞胚胎发生途径1：愈伤组织
诱导愈伤组织形成
愈伤组织胚性化
球形胚形成
子叶胚期
蝴蝶兰,Lin等,2000
悬浮细胞体细胞胚发生过程
愈伤组织
胚性愈伤组织
悬浮培养的胚性细胞团
球形胚形成
成熟子叶胚
外植体（茎段）
愈伤组织
器官发生途径
胚状体
茎尖或
带芽的茎段
体细胞胚发生途径
铁皮石斛
再生幼苗
根、芽等组织器官
再生幼苗
茎尖或带芽的茎段
细胞分裂素浓度高
结合图2-5思考：为何茎尖/带芽的茎段即可不经过愈伤组织阶段？
丛状苗
发芽
生根
途径一：器官发生路径
途径二：体细胞胚发生路径
Q1：两条路径中与胚胎状态功能相近的是？
Q2：如何调控植物组织培养途径？
胚性细胞→细胞团→球形胚→心形胚→鱼雷胚→胚状体/体细胞胚→幼苗
离体植物器官、组织和细胞在适宜条件下方可发育成完整的植株
适宜的温度
无菌条件
充分而全面的营养
适宜浓度和配比的植物激素
影响能否成功再生出植物的因素有哪些？
思考：
植物材料种类、基因型
1、植物组织培养是在严格的无菌条件下进行的
外植体？接种器具和培养基？接种室和操作台？
二、离体植物器官、组织和细胞在适宜条件下方可发育成完整植株
大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等；
微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；
有机物：糖类、氨基酸、维生素
2、培养基能为离体植物材料提供适宜的营养条件
MS培养基
既可以作为碳源和能源物质，又参与维持培养基的渗透压
辅酶
水, 无机盐，有机营养成分，琼脂，植物激素
蔗糖
配制母液
母液：将大量元素、微量元素和有机成分分别配成浓度为配方的5--10倍的溶液即为母液，用时稀释。（减少每次配制培养基的麻烦及减少称量微量试剂的误差。）
植物组织培养时为什么添加蔗糖而不是葡萄糖？
①同样作为碳源和能源物质，蔗糖较葡萄糖能更好地维持培养基内的低渗环境。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。
②植物组织培养过程中，要特别注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖，而较少利用蔗糖，因此采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少微生物的污染。
③从能源供应来说，相同物质的量浓度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多
④葡萄糖作为碳源时，培养灭菌时会碳化。
⑤诱导作用：在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。
MS培养基
发芽培养基
生根培养基
MS＋NAA 0.3mg/L
MS＋6-BA 1.0mg/L＋NAA 0.2mg/L
为什么用人工合成激素类似物？
天然植物激素在植物体内都有相应的使之分解的酶，所以作用的时间短。而人工合成的植物激素类似物，在植物体内没有使之分解的酶，作用的时间长，效果显著，生产成本低。
3、植物激素调控细胞的脱分化和再分化过程
植物生长调节物质
3、植物激素调控细胞的脱分化和再分化过程
①比例合适，愈伤组织就会分化出______________。
②细胞分裂素太多，只长______，不长_________
③生长素太多，只长________，不长_________
④生长素少，细胞分裂素也不多时，则愈伤组织继续___________________
根和茎叶
茎叶
根
茎叶
根
生长，不发生分化
光照强度、光周期、光质对器官发生、形态建成的影响
外植体
愈伤组织
再生植株
丛状苗
外植体消毒：多种药剂配合，无菌水清洗
脱分化
培养基
再分化
发芽培养基
再分化
生根培养基
BA>NAA
BA知识总结
（一）原理：植物组织培养的基本过程
外植体
愈伤组织
丛芽、生根
完整植株
脱分化
再分化
外植体
丛芽、生根
完整植株
细胞分裂素多，生长素少
生长素
丛状苗
活动:菊花的组织培养及幼苗的移栽
原理：通过调节激素的_____可控制菊花外植体的生长发育
比例
（二）实验材料
菊花
★带芽的枝条
活动:菊花的组织培养及幼苗的移栽
有腋芽，也就有了分生组织，可不经脱分化直接发芽
制备MS
固体培养基
外植体消毒
接种
培养
栽培
移栽

（三）实验过程
外植体消毒
①材料：
幼嫩的带芽菊花茎段
②消毒：
75%酒精
30S
洗涤灵稀释液
2min
流水
流水
次氯酸钠10min/氯化汞5~7min
多次
无菌水洗
超净工作台或接种箱
③切割（无菌操作）
每一茎段至少带有一个芽
无菌纸
无菌条件下操作
操作始终在_______进行，
插入的时候要注意方向，不能_____。
每瓶接种_____块外植体。
制备MS
固体培养基
接种
培养
栽培
移栽

火焰旁
倒插
外植体消毒
1 - 3
（三）实验过程
制备MS
固体培养基
接种
培养
外植体消毒
温度：________；光照：保持每日_____。
18-25℃
10-12h
移栽
栽培
生根培养：
在______上将试管苗分割成单株后，接种在__________，
每瓶培养基插苗4-5颗。
无菌纸
生根培养基
温度：________；光照：保持每日_____。
20-28℃
10-12h
发芽培养：
（三）实验过程
丛状苗
更换培养基
生根
Q4:组培环境与自然环境有哪些差异？
制备MS
固体培养基
接种
栽培
移栽
外植体消毒
培养
(1)炼苗。移栽前应先打开瓶口，让试管苗在培养间放置1-2天。
(2)培养基质的灭菌。蛭石和珍珠岩高压蒸汽灭菌
(3)育苗盘的准备。
(4)试管苗的清洗。用流水清洗根部的培养基。
(5)试管苗的栽种。培养基质要处于水饱和状态
(6)管理及培养。温室，定期打开保鲜膜透气，初期避免强光直射
（三）实验过程
温度、湿度、无菌环境、培养基质等环境的变动
变化：培养基→草炭土或蛭石
5、适应锻炼
二、组织培养的过程
80％以上→→→自然湿度
（基质）
（湿度）
逐渐降低
草炭土是沼泽发育过程中的产物。是古代低温、湿地的植物遗体，被埋在地下，经数千万年的堆积，在气温较低、雨水较少或缺少空气的条件下，植物残体缓慢分解而形成的特殊有机物。含有大量水分和未被彻底分解的植物残体、腐殖质以及一部分矿物质。有机质含量在30％以上，质地松软。它独特的质轻，持水、透气和富含有机质使其成为一种很好的栽培基质。
蛭石是一种天然、无毒、在高温作用下会膨胀的矿物质。由于蛭石有离子交换的能力，它对土壤的营养有极大的作用。蛭石具有的吸附功能和阳离子的交换性能可以对土壤的机构进行优化，吸收大量的水分从而起到保墒的作用，而且更能让土壤变得更松散利于其透气，另外蛭石更可以在农作物的生长中促使肥料缓慢在生长介质中释放，从而利于作物的快速生长。
植物由一种生长环境转到另一种差异较大的生长环境的适应过程，如引进一种植物先要对其进行炼苗，也就是驯化。试管苗是在适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件和近乎100%的相对湿度等相对优越的环境条件下生长的。主要的炼苗障碍是湿度，试管苗叶片角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛。叶片上甚至出现了大量的水孔，此外，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。当将它们直接移栽到自然环境中，试管苗蒸腾作用极大，失水率很高，非常容易死亡。
知识拓展
蛭石：
蛭石为云母类矿物，具有良好的缓冲性，不溶于水，并含有可被花卉利用的镁和钾，为无土栽培的优良基质。蛭石偏碱性，在无土栽培中常用pH5.5～6.5的酸液处理后再使用。如与强酸性的草炭混合使用。蛭石可连续使用l～2次。珍珠岩和蛭石用于园艺是近代的事情，它们的作用类似于沙子，掺入土中使土壤的透气性、排水性提高，而且保水保肥能力要比沙子强。
幼 苗
愈伤组织
脱分化
CTK/IAA比例适合
再分化
CTK/IAA比例先增大在减小
植物组织培养过程示意图
完整植株
外植体
2010年浙江理科综合试题
例题2．将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是
答案：B
Q5:造成污染的途径可能有哪些？
小思考：在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？
【答案】植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污
染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。
1.不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度？
不可以，不同植物或同一植物不同器官脱分化、再分化所需要激素种类和比例可能不同。
讨 论
2.本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么？
天然植物激素在植物体内都有相应的使之分解的酶，所以作用的时间短。
而人工合成的植物激素类似物，在植物体内没有使之分解的酶，作用的时间长，性质稳定，效果显著，成本低，与天然激素有相同的作用。
4.通过外植体的培养得到了丛状苗，若要对丛状苗进行继代培养以扩大繁殖而获得更多的试管苗，你认为该如何操作？
将外植体培养得到的试管苗进一步切割为带芽的茎段，接种在细胞分裂相对较多、生长素含量相对较少的培养基中培养。
3.如何调控离体植物细胞的脱分化和再分化
提示 植物激素调控细胞的脱分化和再分化过程,主要是通过调控培养基中生长素和细胞分裂素(或人工合成的激素类似物)的浓度和配比来实现的。
4.在菊花组织培养过程中,是否需要光照条件
提示 在愈伤组织的诱导阶段往往要避光培养,有利于细胞脱分化产生愈伤组织(如果是在光照条件下,容易分化产生维管等组织,不利于产生大量的愈伤组织)。当愈伤组织分化出芽和叶时,一定要有光照,有利于叶片内叶绿素的合成。
三、植物组织培养通过多种途径有效地提高生产效率
铁皮石斛的工厂化生产
（一）植物组织培养技术可快速繁殖植物
（1）初代培养: 外植体的第一次培养
（3）优点:
①保持优良品种的遗传特性
②便于控制条件和培养基成分
（2）继代培养: 将初代培养获得的培养物转移到新的培养基上继续进行扩大培养
例：将芽丛切割分离，进行继代培养，扩大繁殖。每代增殖3~4倍，为了防止变异或突变,通常只继代培养10~12次。根据需要，一部分进行生根培养,一部分仍继代培养。
三、植物组织培养通过多种途径有效地提高生产效率
Q1：植物组织培养的两种分类标准？
Q2：能否一直继代培养下去？
植物克隆
Q3：植物组织培养的影响因素？
继代培养次数
脱毒马铃薯田与被病毒感染未脱毒马铃薯叶片
（二）植物组织培养技术可用于作物脱毒
（1）适用对象：
被病毒感染的无性繁殖的作物。
（2）脱毒过程：
无病毒组织：如茎尖组织
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
脱病毒苗
完整植株
移栽成活
原因：马铃薯和草莓都是无性繁殖的作物，它们感染的病毒很容易通过无性繁殖器官传给后代，病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低，品质变差。
植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒
（三）植物组织培养技术可用于生产人工种子
玉米种子纵切图
体细胞胚
②制作方法：
将植物离体培养产生的体细胞胚、芽、愈伤组织等包埋在含有营养成分和保护功能的物质中
①结构及其作用（见图）
有机薄膜
含体细胞胚萌发所需的营养成分和植物激素
③优点：
生产过程不受季节限制；
可以大量、快速繁殖优良品种
1.突变体的利用
（1）原理：
培养细胞一直处于不断增殖的状态，易受到培养条件和外界压力（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。
（2）过程：
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
突变体
筛选培育
新品种
诱变处理
（2）技术手段：
抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草等。
染色体畸变/基因突变和植物细胞的全能性。
（四）植物组织培养技术可用于作物新品种的培育
诱变育种
（3）实例：
体细胞无性系变异和离体诱变技术
植物体细胞在组织培养过程发生变异，导致再生植株发生遗传改变的现象
对哪个阶段进行诱变处理最佳？
秋水仙素处理，染色体数加倍
花药离体培养
单倍体植株
正常纯合体植株
2.单倍体育种
（1）过程
脱分化
愈伤组织
再分化
（2）原理：
染色体（数目）变异
（四）植物组织培养技术可用于作物新品种的培育
（3）优点：
①极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力：
杂交育种培育一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般不断自交选优，常需5～6年。而单倍体育种当年就能培育出所需纯合体。
②可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料：
大多数单倍体植株的细胞中只含一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现。
（4）实例：
我国培育的单育1号烟草是世界上第一个单倍体作物新品种
2.单倍体育种
3.转基因植物
离体器官、组织、细胞、原生质体均可作为外源基因的受体
红豆杉
天然珍稀抗癌植物
抑制癌细胞的有丝分裂
治疗类风湿性关节炎、老年痴呆都有一定的效果
紫杉醇
晚期癌症的最后一道防线
对晚期乳腺癌、肺癌、消化道癌等多种癌症具有显著疗效
濒临灭绝
有没有什么方法能快速繁殖红豆杉
？
临床结果发现，紫杉醇对黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等多种癌症都有一定疗效！
沃尔和瓦尼从12公斤紫杉树皮中只提纯得到了0.5克的紫杉醇，收率非常低，只有0.004%。36株60年生大树的树皮中只能提取到1g用于治疗1个癌症患者。红豆杉生长速度慢，直径为20cm的树需要生长10年，获得25kg紫杉醇就需要毁树38000株，而紫杉醇的年需求量达到500kg！
紫杉醇促进微管蛋白聚合、防止微管的解聚，阻碍了纺锤体的形成，这就会让细胞在分裂过程中被卡住了，所以细胞就会发生凋亡
细胞代谢产物
Q：如何提高植物组培用于细胞代谢产物的工业化生产的效率？
（五）植物组织培养技术可用于细胞代谢产物的工业化生产
蛋白质,脂肪,糖类,药物,香料,生物碱等。
1.细胞产物种类：
含量很低，从植物组织中提取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到。
将愈伤组织或易分散的组织置于液体培养基中进行悬浮培养。
2.技术：
外植体
脱分化
愈伤组织
细胞产物
培养、提取
（1）取材：自然生长的茎
要求：无菌幼苗切段,每段至少1张叶片
原因：保存了腋芽（具有较强的分裂能力），
有利于外植体的培养
结合新教材P49活动
（1）剪取一段茎
茎尖
（2）倒入70%酒精处理10分钟
倒去酒精
放入5%次氯酸钠浸泡5分钟
倒去次氯酸钠
用另一5%次氯酸钠浸泡5分钟
倒去5%次氯酸钠
无菌水冲洗
取出茎尖
在滤纸上吸干水分
（3）茎段接种生芽培养基中
茎段接种生芽培养基中
盖上封口膜
22、重新封好瓶口c
盖上封口膜
（4）生芽培养：生芽培养基长成丛状苗
18-25℃的温度培养,每天光照不少于14.5h（新教材
10-12h）
思考：先生芽后生根有什么好处？
叶片进行光合作用可以减少培养基中碳源的消耗
（5）丛状苗在无菌条件下转入生根培养基
18~25℃的温度培养,
每天光照不少于10-12h
（6）炼苗：
将苗转移至草炭土或蛭石中逐渐降低湿度进行锻炼
思考1：草炭土或蛭石需要灭菌或消毒吗？
思考2:试管苗移栽需要作什么处理？
灭菌处理
清洗根部琼脂

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