资源简介

(共20张PPT)
生物技术实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
微生物的培养与应用
预习验收
旧知回顾
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质 。
培养基一般都含有水、 、 和 。
培养基
碳源
氮源
无机盐
预习验收
预习验收
实例：
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。
科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶。Taq细菌是美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的。
为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来？
预习验收
热泉70~80℃的条件淘汰了绝大多数微生物。
如何寻找能分解石油的酶？
在富含石油的环境中寻找能分解石油的微生物，从能分解石油的微生物体内分离出能分解石油的酶。
课题背景
课题背景
尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接
被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
芽孢杆菌、假单胞杆菌、某些真菌和放线菌等能分解尿素。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
研究目标
从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
研究目标
筛选菌株
资料1：土壤中含有大量各种各样的微生物。
资料2：只有能合成脲酶的微生物才能分解利用尿素，而氮源是微生物生存必不可少的营养物质。
如何在实验室环境下，从普通土壤中分离到能分解尿素的细菌？
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
土壤中能分解尿素微生物分离所需培养基
唯一氮源
选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制其他微生物生长的培养基，称作选择培养基。
菌落计数
在课题1中，我们学习了稀释涂布平板法。这一方法常用于统计样品中的活菌数目。当稀释倍数足够高时，培养基上的一个菌落，来自于样品稀释液中的一个活菌。
系列稀释
涂布平板
想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
菌落计数
将1克土壤样品稀释106倍后，向培养基中滴加0.1ml土壤稀释液，培养2天后，该培养基长出80个菌落，试计算每克土壤样品中的微生物数目。
每克样品中的菌株数
=（C/V）*M
其中，C代表某稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数。
菌落计数
思考：为什么利用稀释涂布平板法，所统计的菌落数和真实活菌数相比要低？
当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落。
显微镜直接计数法：将样品稀释一定倍数后，利用血细胞计数板进行计数。
菌落计数
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，结果如下。
同学1在稀释倍数106下涂布一个平板，统计菌落数为230。
同学2在稀释倍数106下涂布三个平板，统计菌落数分别为21、212、256，该同学取平均值为163为统计结果。
两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？
同学1只涂布了一个平板，为避免偶然性一定要涂布至少三个平板；
同学2第一组实统计数据与后两组相差过大，可能是在操作中出现失误，应该重新实验，并且应该选择菌落数30~300之间的平板进行计数。
菌落计数
在本课题实验中，A同学从稀释106倍的培养基中筛选出大约150个菌落。但是其他同学在同样的稀释度下只筛选出大约50个菌落。
其他同学认为A同学的培养基污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质。而A同学确信自己操作无误，结果不同是因为选用的土样不同。但是A同学在设计实验时没有设置对照，所以拿不出令人信服的证据。
你能通过设置对照，帮助A同学排出上述两个可能影响实验结果的因素吗？
排除培养基污染问题：
在实验组之外再设置一组空白对照，即不接种的以尿素为唯一氮源的培养基，恒温培养，观察是否长出菌落。
排除培养基混入其他含氮物质问题：
在实验组基础上增加一个加入其他氮源的完全培养基作为对照，接种之前配置好的土壤稀释液，恒温培养，观察培养基中长出的菌落数目和种类是否与实验组相同。
菌落计数
指除了被测试条件以外，其他条件相同的实验。其作用是，排除其他任何可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应结果
菌落计数
利用稀释涂布平板法进行活菌计数的注意事项：
当 时，培养基表面的一个菌落，来自于样品稀释液中的一个活菌。
统计样品中的细菌数时，至少要涂布 个平板。
为保证结果准确，一般选用菌落数在 的平板进行计数。
为排除干扰，试验时应该设置 。
利用该方法统计到的菌落数一般 实际活菌数。
稀释倍数足够高
3
30~300
对照组
低于
实验原理
实验原理
分离原理：利用以 为唯一氮源的 培养基，分离土壤中能分解尿素的微生物
计数原理：利用 进行活菌计数。
尿素
选择
稀释涂布平板法
实验设计
实验设计
实验设计
资料一：土壤微生物以细菌为主，细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层。
资料二：为保证平板上的菌落数在30~300之间，测定土壤中的细菌数量一般选用104、105、106倍稀释；真菌一般选用102、103、104倍的稀释；放线菌一般选用103、104、105倍稀释。
资料三：细菌一般在30~37℃下培养1~2d；霉菌一般在25~28℃下培养3~4d；放线菌一般在25~28℃下培养5~7d。在本实验中可以每隔24h统计一次菌落数，直到菌落数目稳定时记为结果。
根据以下资料设计实验
实验设计
土壤取样
制备培养基
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
铲去表层土，取距地表3~8cm土壤层
以尿素为唯一氮源的选择培养基/牛肉膏蛋白胨培养基
一个空白对照，每个稀释度涂布三个选择培养基和一个牛肉膏蛋白胨培养基
24h记录一次，直到菌落数目稳定。
注意事项：
实验时注意无菌操作并对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养日期、平板上培养样品的稀释度、培养物等。
结果分析
培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
空白对照培养基_____________，说明培养基没有污染。
牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目_______选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
无菌落生长
明显大于
课题延伸
原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的pH升高。因此，可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。
思考：能在该选择培养基上生长的细菌一定是尿素分解菌吗？
方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养基某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
酚红

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