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(共26张PPT)
参与的微生物 参与微生物是真核生物还是原核生物 参与微生物 的呼吸类型 适宜温度 发酵产物
葡萄酒 酵母菌 真核生物 兼性厌氧型 18-30℃ 酒精
泡菜、酸奶 乳酸菌 原核生物 厌氧性 18-20℃ 乳酸
葡萄醋 醋酸菌 原核生物 需氧型 30-35℃ 乙酸
腐乳、酱、酱油 毛霉 真核生物 需氧型 15-18℃ 小分子肽和氨基酸
1.2微生物的培养技术及应用
高压蒸汽灭菌
液体培养基
第一章传统发酵技术的应用
一、微生物的基本培养技术
1.微生物的类群
原核生物 (细菌、蓝细菌等)
原生生物 (如草履虫、衣藻等)
真菌 (如酵母菌、霉菌等)
酵母菌
青霉菌
大型真菌
球菌
蓝细菌
草履虫
衣藻
病毒（无细胞结构）
禽流感病毒
SARS病毒
难以用肉眼观察的微小生物的统称
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
一.培养基的配制
1.培养基概念：
2.培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3.培养基类型：
①按物理状态来分：可分为液体培养基、固体培养基等。
固体培养基
液体培养基
←无 有→ 凝固剂琼脂
是一种从红藻中提取的多糖。在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈固态。
划分 培养基种类 特点 用途
物理 性质
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定。
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
4.培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
1）碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏等
自养微生物
异养微生物
2）氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
蛋白胨、尿素、氨基酸等
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（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
添加维生素
调至酸性
调至中性或弱碱性
提供无氧的条件
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
注意
(1)加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
菌落：单个或少数同种菌体在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
沙门氏菌
(2)微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落
毛霉
1.消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
（1）概念：
（2）消毒的方法：
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
获得纯净培养物的关键是什么？
——防止外来杂菌的入侵
二.无菌技术
2.灭菌
　　
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌的方法：
芽孢
有些细菌在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
注：使用后的培养基必须灭菌后
才能丢弃，以免污染环境。
①湿热灭菌：
高压蒸汽灭菌锅
（2）灭菌的方法：
高压蒸气灭菌（效果最好）：
100kPa、121℃下维持15-30min.常用于培养基、无菌水等的灭菌。
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
　　
③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
常用于涂布器、接种环、接种针、试管口等的灭菌。
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和杀死部分微生物
强烈、杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
3.消毒与灭菌的比较
接种室、接种箱，超净工作台
注意
实验前：
对操作空间、操作人员消毒
对所用器皿、接种用具和培养基灭菌
操作时：
在超净工作台上并在酒精灯火焰附近无菌区操作
避免已灭菌处理材料再次污染
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
三.微生物的纯培养
培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
具体过程：
配置
培养基
灭菌
接种
分离
培养
1.制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
1.制备培养基
1）配制培养基
2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.
包器材
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。（有时需调pH）
倒平板的具体操作：
3）倒平板
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。
培养基
约50℃
2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
问题讨论
2.接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
(1)“平板划线”实验操作
连续划线法
分区划线法
平板划线法注意事项:
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2.在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞。
3.将试管口通过火焰。
4.将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液 。
5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基！
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
1
2
3
4
5
该平板划线一共灼烧几次接种环
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上原有微生物
⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
1.培养基的制作是否合格？
2.接种操作是否符合无菌要求？
3.是否进行了及时细致的观察与记录？
培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
结果分析与评价
稀释涂布平板法
平板划线法
练习与应用
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。 （ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 （ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
练习与应用
一、概念检测
A
B
C
D
E
F
G
B、G、E、A、C、D、F
请排序：

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