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微生物的培养与应用
考点一 微生物的实验室培养
微生物：肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。
微生物
原核:
真核
非细胞类：
细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次式体、蓝藻等
酵母菌、霉菌等
真菌：
原生生物
病毒、类病毒、朊病毒等
单细胞藻类：衣藻、小球藻等
原生动物：草履虫、变形虫等
微生物的特征：①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小；⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
营养物质的种类：
人和动物：
水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素等；
营养物质：指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。
植物：
矿质元素、碳源（蔗糖）、维生素、生长调节剂等；
微生物：
碳源、氮源、水和无机盐、特殊营养物质、特定pH及O2的需求。
培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
培养基的成分
概念 来源 作用
碳源
氮源
提供碳元素的营养物质
无机碳源： CO2、HCO3-等
有机碳源：糖类、脂肪酸、牛肉膏、石油等
①构成细胞物质和一些代谢产物
②异养微生物的能源
无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等
有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
提供氮元素的营养物质
主要用于合成蛋白质、核酸等
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
水
良好溶剂，参与物质运输；参与细胞内一系列化学反应等
无机盐
参与重要化合物的组成；调节并维持细胞的渗透压；调节PH的平衡。
生长因子
微生物生长所必需的、微量的、自身不能合成或合成很少的有机物。
作用：
酶和核酸的组成成分
种类：
来源：
激素、维生素等
酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、动植物组织提取液等
概念：
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
培养基的分类
划分标准 培养基种类 特点 应用
按物 理性 质分 液体培养基 不加凝固剂 工业生产（扩大培养）
半固体培养基 加凝固剂 (如琼脂) 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基 微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保存
按化 学成 分分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确 微生物的分离、鉴定
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
培养基的分类
（3）按目的用途分
选择培养基——在培养基中加入或减少某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。
加入高浓度食盐的培养基 -分离
不加氮源的无氮培养基 -分离
不加含碳有机物的无碳培养基 -分离
只加尿素为唯一氮源的培养基-分离
只加纤维素为唯一碳源的培养基-分离
鉴别培养基——添加某指示剂或化学药剂，用于菌种鉴别。
伊红美蓝培养基鉴别饮用水中是否有大肠杆菌（菌落呈深紫色）
金黄色葡萄球菌（耐盐细菌）
固氮菌
自养型微生物
尿素分解菌
纤维素分解菌
考点一 微生物的实验室培养
1、培养基的配制
配制培养基时：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
细菌pH为：6.5-7.5； 放线菌pH为：7.5-8.5； 真菌pH为：5.0-6.0
考点一 微生物的实验室培养
2、无菌技术
（1）获得纯净培养物的关键是 ， 防止外来杂菌入侵的保证是 。
防止外来杂菌的入侵
无菌技术
（2）无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法，主要是消毒和灭菌。包括：
超净工作台
实验操作空间消毒
操作者的手、衣着消毒
实验用具、器皿、培养基灭菌
实验操作过程，酒精灯火焰附近进行
实验操作时，避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
考点一 微生物的实验室培养
2、无菌技术
消毒-使用较温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
灭菌-使用强烈的理化因素杀死物体内所有的微生物，包括芽孢和孢子。
（3）消毒和灭菌
消毒的方法：
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线30min消毒
灭菌的方法：
灼烧灭菌：接种环、接种针、试管口、瓶口
干热灭菌：玻璃器皿和金属用具
湿热灭菌：高压蒸汽灭菌（100kPa、121 ℃下维持15-30min ）
考点一 微生物的实验室培养
2、无菌技术
判断以下需要哪种消毒或灭菌方法
1.日常生活常用 ；对不耐高温的液体，用 。
2.接种室、接种箱、超净工作台喷洒石炭酸或煤酚皂以增强 效果。
3.操作者双手用酒精 ；饮用水源用氯气等化学药物 。
4.表面灭菌和空气灭菌用 ；接种环、接种针、试管口 。
5.玻璃器皿、金属用具用 。培养基、无菌水用 。
6.培养皿用 。
7.实验结束后，使用后的培养基应进行 处理，才能扔掉。
煮沸消毒法
巴氏消毒法
消毒
消毒
化学药剂消毒法
紫外线消毒
灼烧灭菌
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
干热灭菌
灭菌
做好消毒或灭菌后，避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。为避免周围环境中微生物的污染，许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
考点一 微生物的实验室培养
3、酵母菌的纯培养
（1）纯培养物及纯培养：
由单一个体繁殖所得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程称为纯培养。
（2）菌落
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，即菌落。
大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。
鉴定菌种的重要依据。
特征：
功能：
定义：
考点一 微生物的实验室培养
3、酵母菌的纯培养
（3）培养基的制备、灭菌、倒平板
加琼脂的目的：
作为凝固剂
在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的：
在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。
培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。估量培养基温度的方法是：
用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。
倒平板时将锥形瓶的瓶口通过火焰的目的：
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
平板冷凝后，将平板倒置的原因：
在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
使培养基表面的水分更好地挥发及防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，可能是哪些原因引起的？
无菌落生长。否则可以灭菌不彻底，杂菌感染等
3、酵母菌的纯培养
（3）培养基的制备、灭菌、倒平板
考点一 微生物的实验室培养
接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。
划线首尾不能相接。
划线后，培养皿倒置培养12~24h。
1
1.线条不重叠
2
2-3.从上次的末端开始，交叉2~3条线
3
4
4.最后的划线不能与第一区相连。
3、酵母菌的纯培养
（4）接种和分离酵母菌——平板划线法
考点一 微生物的实验室培养
3、酵母菌的纯培养
（4）接种和分离酵母菌——平板划线法
考点一 微生物的实验室培养
灼烧接种环的目的：
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
3、酵母菌的纯培养
（4）接种和分离酵母菌——平板划线法
考点一 微生物的实验室培养
灼烧接种环后需冷却后再划线：
以免接种环温度太高，杀死菌种。
总是从上一次划线的末端开始划线的目的：
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
培养基上观察到了不同形态的菌落，说明：
可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等。
考点一 微生物的实验室培养
4、微生物的选择培养——选择培养基
原理：
人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
举例：
（1）利用改变培养条件进行选择培养。
70～80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
（2）利用营养条件进行选择培养
不加碳源（含碳有机物）的培养基
分离出自养型微生物
不加氮源的培养基
分离出固氮菌
（3）利用添加某种化学物质进行选择培养
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
考点一 微生物的实验室培养
4、微生物的选择培养——稀释涂布平板法
①涂布的操作应在酒精灯火焰旁进行;
②涂布器末端用体积分数为70%的酒精消毒，取出后要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；
③不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
稀释涂布平板法既可以获得单菌落，也能对微生物进行计数；
平板划线法可根据菌落特点获得某种微生物的单细胞菌落。
考点一 微生物的实验室培养
4、微生物的选择培养——计数方法
活菌计数法：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
考点一 微生物的实验室培养
4、微生物的选择培养——计数方法
血细胞计数法
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后计算一定体积里样品中微生物的数量。
优点：快速直观
缺点：
不能区分死菌与活菌，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和；
不适于对运动细菌的计数。
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验设计
土壤
取样
样品稀释
涂布平板
微生物的观察培养
细菌的计数
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。绝大部分细菌分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验设计
土壤
取样
样品稀释
涂布平板
微生物的观察培养
细菌的计数
测放线菌数：选用103、104、105倍稀释
测真菌数：选用102、103、104倍稀释
测细菌数：选用104、105、106倍稀释
分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验设计
土壤
取样
样品稀释
涂布平板
微生物的观察培养
细菌的计数
每个倍数的稀释液涂布三个平板（重复实验）
设置空白对照，涂布等量无菌水
要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验设计
土壤
取样
样品稀释
涂布平板
微生物的观察培养
细菌的计数
放线菌：25-28℃,5-7d
霉菌：25-28℃,3-4d
细菌：30-37℃,1-2d
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。
选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
刚果红
纤维素
红色复合物
纤维素酶
纤维素分解菌
红色消失，出现透明圈
土壤取样
样品稀释
样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
挑选产生透明圈的菌落
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
纤维素分解菌的分离
(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
有关本实验的叙述，错误的是(　　)
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
C
(2019·高考全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是______。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是___________________________________________________________。
W
乙
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W　
(2019·高考全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______________________________________________________。
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源　
(2019·高考全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明____________________________。
缓冲液
缓冲液不能降解W　
酶E与天然酶降解W的能力相近

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