资源简介

(共23张PPT)
第2节 微生物的基本培养技术及应用
二、微生物的选择培养和计数
教学目标
阐明微生物选择培养的原理。
2. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
美国黄石公园
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一的水生栖热菌菌种？
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］是一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同
选择培养基
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离自养型微生物
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
③ 不加含有机物的培养基
① 加入青霉素的培养基
2.选择培养基：
(青霉素能杀死细菌)
实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件(营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
典例1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的能力
√
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌该进行什么操作：
2、实验的具体操作：
2）土壤取样：
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
1）制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
1、方法：
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
第一步：分离纯化
第二步：计数
稀释涂布平板法
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
注意：在火焰旁操作
3）样品梯度稀释
1×10
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
5）待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。观察并计算菌落数量
4）涂布：
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开（可计数），
但操作复杂
平板 示图
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 两种分离纯化细菌方法的比较
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
选择30-300个菌落的平板进行计数；至少取3个平板取其平均值
统计的菌落往往比活菌的实际数目 ；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
恰当的稀释度（一般选用104、105、106稀释液）、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
②计数原则:
1. 间接接计数-- 稀释涂布平板法
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
少
1.请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。
1.1×108
核心探讨
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
M --稀释倍数
C --稀释后平板上生长的平均菌落数
V --涂布平板时所取的稀释液体积(mL)
例题1：某同学将10g土样稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A . 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D . 23.4
B
3. 计算：
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M --稀释倍数
C --稀释后平板上生长的平均菌落数
V --涂布平板时所取的稀释液体积(mL)
不能区分死菌与活菌；
2. 计数板计数法 -- 直接计数
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数
1.对土壤中分解尿素细菌的分离与计数是否要对照组，如果要该如何设置，所起的作用是？
不涂布稀释液的选择培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌、
2.对土壤中分解尿素细菌的分离与计数时如果要判断选择培养基是否具有选择作用，该如何设置实验？
接种到牛肉膏蛋白胨培养基
3.得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用(P20)
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
练习与应用(P20)
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
1.培养基的制备
②配方：
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意:
2.实验设计
（1）土壤取样
一般选用104、105、106稀释液进行平板培养
（2）样品的稀释与稀释涂布平板法接种
在初次实验中，选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
（3）微生物的培养与观察
3组接种的选择培养基 用以分离并计数能分解尿素的细菌
第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基 用以判断选择培养基是否具有选择作用
第5组不涂布稀释液的选择培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌
第6组牛肉膏蛋白胨培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌
前3组实验组分离得到单菌落；
第4组得到多种菌落；
第5,6组正常情况下无菌落。
3.注意事项
①实验组：
②对照组：
③实验结果：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
pH升高，酚红指示剂变红
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
补充拓展：土壤中尿素分解菌的鉴定

展开更多......

收起↑