资源简介

(共39张PPT)
专题2 :微生物的培养与应用
课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌能利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
4、课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目
㈢.设置对照
1、实例： PCR技术
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
㈠.筛选菌株
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；
方法：
⑴抑制大多数微生物的生长
⑵促进目的菌株的生长
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
15.0g
琼脂
1.0g
尿素
10.0g
葡萄糖
0.2g
MgSO4`7H2O
2.1g
NaH2PO4
1.4g
KH2PO4
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖 氮源：尿素
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为唯一氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理：
以尿素作为唯一氮源
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基
选择培养基：
5、怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
（完全培养基）
是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
实验组
对照组
培养基类型
是否
接种
目的
结果
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
（设置对照试验）
观察菌落数目的多少
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
㈡.统计菌落数目：
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
缺点：
显微镜直接计数法
1mm
血细胞计数板
2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
？
说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。
⑴土样不同
⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
假设一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
假设二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。（用空白对照）
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
如何验证
（三）设置对照：
①判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养，作为对照组（空白对照）。
②判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目，作
为对照组。
主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
※实验基本原则
1、平行重复原则
2、对照原则
3、单一变量原则
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。
条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。
自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。
相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
二、实验流程:
从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。因为微生物绝大多数分布在距地表3-8cm的土层中，先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
土壤有“微生物的天然培养基”之称
[一]土壤取样：
土壤中微生物数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
[二]制备培养基：
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。
可准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。
稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
（三） 样品的稀释：
将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
稀释倍数 目的
细菌 104、105、106 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
放线菌 103、104、105
真菌 102、103、104
原因：不同微生物在土壤中含量不同
㈣.取样涂布：
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
◆如果得到了至少2个菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
㈤.微生物的培养与观察：
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。
选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
（六）菌落计数：
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
微生物的培养与观察
菌落的形状、大小、隆起程度和颜色
操作提示
[一]无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
[二]做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品
的稀释度等。
[三]规划时间
三、
四、课题成果与评价
培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
　　 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
五.分离尿素细菌的鉴定：
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
pH升高
指示剂（酚红）将变红
2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
六.课外延伸
本课题知识小结:
六、例题解析
例1．对细菌群体生长规律测定正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
答案：A
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ 　）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质
2.使用选择培养基的目的是（ 　）
A.培养细菌　　
B.培养真菌　　
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
实践训练
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ 　）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　　）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
B
C
练一练
用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ）
A.比实际值高
B.比实际值低
C.和实际值一致
D.比实际值可能高也可能低
B
下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
1

展开更多......

收起↑