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(共24张PPT)
甲型H1N1流感是一种急性呼吸道传染病，流感本身跟普通感冒都属于上呼吸道感染，二者的区别主要有两点：一是流感患者往往会出现全身难受的症状，包括四肢酸疼、腰背酸疼以及头疼等，这些症状会比普通感冒更重；二是一部分的流感病人还会出现胃肠道症状，比如呕吐、腹泻
“甲流”症状比普通感冒更重，持续时间更长。绝大多数普通感冒可能2至4天就可以康复，但流感如果在缺乏有效治疗的情况下，大多数病人可能需要一周甚至更长时间才能康复。
如何检测是否感染甲型流感病毒？
已知其病原体甲型H1N1流感病毒是一种RNA病毒，其表面有一种特征性蛋白质A
1、传统抗体制备方法及缺陷
特异性差（能识别多种抗原），纯度低，灵敏度差
抗原决定簇多种
抗体不纯
筛选单一B细胞
不能无限增殖产生大量抗体
抗原 动物体内 抗体
刺激
浆细胞
多克隆抗体
抗原决定簇
病原体、抗原、抗原决定簇、抗体、B淋巴细胞的对应关系？
寿命有限
①过程
②缺陷
一群识别不同抗原部位的抗体
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验
【一个大胆的猜想】
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
既能产生特异性抗体，又能在正常培养条件下进行无限增殖
能产生特异性抗体
能无限增殖
每一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，即克隆。就称为单克隆抗体。
由一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的单一型抗体分子
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
3.3 通过细胞融合可产生具有新特性的细胞
1.概念：
2.范围：
在一些融合因子的作用下，将两个或多个细胞合并形成一个细胞的技术。
细胞融合技术
①基因型相同的细胞间
②基因型不同的同种生物细胞间
3.诱导方式？
③亲缘关系非常远的不同种生物细胞间
资料1：1838年在肿瘤中观察到了细胞融合后的多核细胞，并在此后，相继于肺结核、天花脓包周围、水痘损害的皮肤、麻疹患者的扁桃体等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。1973年观察到天花病人血液中也有多核的血细胞存在
肺结核病人病理切片
1875年，科学家们首次观察到了脊椎动物（蛙）血液细胞的融合现象。1958年，日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。
①物理法：电流刺激（电脉冲）、激光融合
②化学法：聚乙二醇（PEG)
③生物法：灭活的病毒
（动物细胞融合特有）
3.诱导方式
一、两个或多个动物细胞经诱导可融合形成一个细胞
灭活的病毒诱导机理
什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
↓
细胞膜被病毒颗粒穿通
↓
细胞膜连接
↓
细胞核融合，形成杂交细胞
直流电脉冲诱导下极化，膜两侧产生电势，正负电荷相吸
↓
膜变薄，触发膜穿孔，细胞桥形成
↓
细胞质渗透、细胞核融合
电脉冲诱导诱导机理
4.诱导机理/原理：细胞膜出现一定程度损伤，细胞相互粘连而融合。
细胞膜的流动性
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
动物细胞融合
单克隆抗体
杂交瘤细胞
能产生特异性抗体
能无限增殖
小组任务：
结合书本尝试完善上图“抗甲流病毒单克隆抗体制备方案”
①原理：一个（或一种）浆细胞只能产生一种抗体，小鼠的骨髓瘤细胞能够无限增殖，因此，杂交瘤细胞就具备了既能无限增殖，又能产生大量单一抗体的特征。其产生的单一抗体即为单克隆抗体
1、单克隆抗体的制备
二、细胞融合技术是制备单克隆抗体的基础
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
分离脾细胞
诱导融合
筛选
B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤
②制备过程
1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验
知识拓展：筛选获得杂交瘤细胞
知识拓展：筛选获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
讨论：如何筛选出杂交瘤细胞并说明筛选机理？
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
原理：
HGPRT-细胞株
培养基加氨基蝶呤
（HAT培养基）
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
分离脾细胞
第二次筛选
HAT选择培养基
克隆化培养，专一抗体检验
诱导融合
筛选
Q1：此时筛选出来的杂交瘤细胞一定是我们需要的么？
①基因相互抑制导致其无法产生抗体
②遗传物质改变（基因突变、染色体变异）导致其无法产生抗体
③多种抗体的杂交瘤细胞混合体系
Q2：如何筛选？
②制备过程
抗体检测板
多孔细胞培养板
阳性孔
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
知识拓展：筛选获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
克隆培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
单克隆抗体
分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
分离脾细胞
第二次筛选
HAT选择培养基
克隆化培养，专一抗体检验
体外培养或
小鼠腹腔内增殖
诱导融合
筛选
特异性强
灵敏度高
可大量制备
②制备过程
Q3：此过程涉及哪些动物细胞工程的技术？
动物细胞融合技术、动物细胞培养
2、细胞融合技术应用：
①利用淋巴细胞和癌细胞的融合，培育__________
②通过人-鼠杂交细胞丢失人的染色体可进行__________
单克隆抗体
基因定位
经免疫的动物脾细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
获得产生相应抗体的B淋巴细胞
第二次筛选：抗体阳性检测获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞
第一次筛选：利用选择培养基（HAT培养基）获得杂交瘤细胞
克隆培养
灭活仙台病毒
B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤
腹腔
腹水中提取
活体体内培养
思考：单克隆抗体制备过程中的几个问题
（2）两次筛选的目的相同吗？
（1）给小鼠注射抗原的目的是什么？
（3）三次培养的目的是什么？
（4）该过程运用了哪些技术？
动物细胞培养技术、动物细胞融合技术。
诱导小鼠体内发生特异性免疫应答，产生效应B细胞（浆细胞）
第一次筛选：淘汰未融合或自融合的细胞，得到杂交瘤细胞。
第二次筛选：淘汰不能产生所需抗体的细胞，最终获得能产生最佳特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞
第一次是培养浆细胞、骨髓瘤细胞，并使两种细胞融合；
第二次是培养杂交瘤细胞，筛选出能产生特异抗体的杂交瘤细胞。
第三次是培养能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，便于提取大量单克隆抗体。
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
诱导融合
选择培养基
克隆化培养，专一抗体检验
体外培养或小鼠腹腔内增殖
既能大量繁殖又能产生专一抗体
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
1、单克隆抗体的制备
③优点
a、特异性强：只能识别特异抗原分子的特定部位
b、灵敏度高 C、可大量制备 d、纯度高
2、单克隆抗体的应用
a.作为诊断试剂——最广泛应用
同位素标记的单克隆抗体，在特定组织中成像，定位诊断相关疾病。
准确、高效、简易、快速
原理：抗原-抗体杂交技术
b.作为特异性的探针，研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及功能
抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体
艾滋病检测试剂
c.用于治疗疾病和运载药物
①特异性强、灵敏度高
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物
②疗效高、毒副作用小
2、单克隆抗体的应用
抗癌药物应用时最大的问题？
“生物导弹”追踪癌细胞
植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；
聚乙二醇融合法
聚乙二醇融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
2.下图为科研工作者利用小鼠制备H7N9禽流感病毒单克隆抗体的过程,请据图回答有关问题。
(1)图中将H7N9病毒抗原基因导入受体细胞常用的方法是　　 。
(2)在受体细胞的培养过程中,为了防止污染,通常还要在细胞培养液中添加一定量的　　　　　　,其培养液与植物组织培养的培养基相比,特有的天然成分是　　　　　 　。

(3)图中X细胞一般选用　　　　　　　 　,与植物体细胞杂交相比,诱导X细胞和Y细胞融合还可采用　　　 　　　　。
显微注射技术
抗生素
动物血清
骨髓瘤细胞
灭活的病毒

(4)单克隆抗体的制备过程需要经过多次筛选,首先用特定的选择性培养基筛选出　　　 　　,最终获得足够数量
的　　　 　 　的细胞，选出符合要求的细胞后,可在体外条件下或注射到　　　　　进行增殖培养。

(5)利用上述技术生产的单克隆抗体可制作成诊断盒,用于准确、快速诊断H7N9禽流感病毒的感染者,这种诊断运用了　　　 杂交技术,这体现了单克隆抗体 　　　　　　　 　的特性。
杂交瘤细胞
能产生所需抗体
小鼠腹腔
抗原—抗体
特异性强、灵敏度高

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