资源简介

(共32张PPT)
了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。
知识目标：
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。
无菌技术的操作。
课题重点和难点：
技能目标：
专题2 :微生物的培养与应用
课题1 微生物的实验室培养
微生物类型
原核生物界
原生生物界
真菌界
病毒界
(细菌、放线菌、蓝藻)
(酵母菌霉菌大型真菌)
(草履虫变形虫衣藻)
(噬菌体、艾滋病毒)
约有10万种
(一)、微生物特点：结构都相当简单,进化地位低，个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.
一、基础知识：
繁殖快 、 代谢类型多、分布广泛 、数量多 、易变异
一、基础知识：
（二）培养基
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（1）按物理状态分：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数、保藏等，液体培养基常用于发酵工业。
1.培养基的类型和用途
注意：目的明确、营养协调、条件适宜、经济节约。
液体培养基与固体培养基
选择培养基:从微生物群中选择具有特定表型的细胞.使之进行繁殖所用的培养基,称为选择培养基.
加入青霉素的培养基:分离到酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:分离到金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基: 分离到固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:分离到自养型微生物
如：当大肠杆菌分解乳糖产酸就与伊红和美蓝结合形成黑色菌落，或带有绿色金属光泽。
鉴别培养基： 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
合成培养基:
天然培养基：
（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。
2.培养基成分
不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、等营养，另外还需要满足微生物生长对pH（真菌5.0-6.0，细菌6.5-7.5，放线菌7.5-8.5）、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气等的要求。
营养要素 定义 作用 主要来源
碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机化合物：CO2、NaHCO3
有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐
有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
琼脂 葡萄糖 尿素 选择 合成 异养型
1、下列是与微生物培养有关的问题，请回答：
某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是＿＿＿＿，碳源是＿＿＿＿，氮源是＿＿＿＿。已知只有能合成脲酶 的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于＿＿＿培养基。按照化学成分分类，该培养基属于＿＿＿培养基。从同化作用类 型上看，用该培养基培养的细菌属于＿＿＿＿。
2.若硝化细菌、圆褐固氮菌、不固氮的蓝藻混合在一起我们配置什么样的培养基即可以将三种微生物分离？
碳源 氮源 能源
硝化细菌 CO2 氨 氨
圆褐固氮菌 糖类等含碳有机物 N2 有机物
不固氮的蓝藻 CO2 铵盐、硝酸盐 光
（三）无菌技术
1.无菌技术
（1）无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
（2）措施 要记忆
（3）旁栏思考：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
在生物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞叫孢子。孢子的特点是能直接长成新个体。
（三）无菌技术
（1）消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线消毒：只适用于表面灭菌和空气灭菌
(1)消毒的方法：
3.常用的消毒与灭菌的方法P15
（2）灭菌的定义：
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌之过程。
灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
1、灼烧灭菌
(2)灭菌的方法：
2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.最常用的。它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
讨论:1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？
在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。
2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？
如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故
3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？
空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染
3、消毒和灭菌是两个不同的概念，下列哪些事物适用于消毒处理(　 　)
①皮肤　 ②饮用水 　③牛奶　 ④注射器　 ⑤培养皿
⑥接种环　 ⑦培养基　 ⑧果汁　 ⑨酱油　 ⑩手术刀
A． ④⑤⑥⑦⑩ B．①②③⑧⑨
C．①②③④⑤⑥⑧ D．以上全部
B
（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5g
将上述物质加少量水（防焦化）溶解后，补加蒸馏水定容至1000ml，调节PH为7.0～7.2。在肉汤培养基中加入15～20g的琼脂，即制成牛肉膏蛋白胨固体培养基。
二、实验操作：
操作步骤
1．计算；2．称量；3．溶化；（调节PH）
4．灭菌；5．倒平板（P17）
1.
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了，防止培养皿受热不均而炸裂。
2.
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
问题讨论
3.
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4.
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
思考：
溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热
②加琼脂的目的是什么 为什么要用玻璃棒搅拌？
③在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有 培养基的锥形瓶的目的是什么？
④培养皿能否用高压蒸汽灭菌？
可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差
作为凝固剂；防止琼脂糊底导致烧杯破裂。
在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用
不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.
3、有关倒平板的操作错误的是（ ）
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置
D. 将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上
D
（二）纯化大肠杆菌
平板划线法
微生物的接种技术介绍
最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
1.
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
问题讨论
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。比较稀疏
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
4.平板划线时不能划破培养基的原因？
4、有关平板划线操作正确的是 （ ）
A．打开含菌种的试管需要通过火焰灭菌，取出菌种后需要马上塞上棉塞
B．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌
C．最后将平板倒置，放入恒温箱中培养
D．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可
C
稀释涂布平板法
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
问题讨论
C
5、平板划线法和稀释涂布平板法接种大肠杆菌的操作中，相同的是 （ ）
①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③菌液均需稀释后再接种④都可以用来计数活菌⑤依据的原理相同⑥都需要在火焰旁进行接种
A．①② B．③④
C．① ⑥ D．②④
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同
1、培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
2、接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
3、是否进行了及时细致的观察与记录
三、课题成果评价
菌种的保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法
课题的延伸
本课题知识小结
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
【典例解析】
右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 ，用来培养金黄色葡萄球菌。
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共
有 类。
自养型微生物
含碳有机物
固氮微生物
3
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则
是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
调整pH
依微生物的生长需要确定
琼脂（或凝固剂）
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml

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