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第三节 动物细胞工程及其应用
第二章 细胞工程
考点：
1、动物的细胞培养与体细胞克隆（A）
2、细胞融合与单克隆抗体（A）
动物细胞工程常用的技术手段：
动物细胞培养、 动物细胞核移植、
动物细胞融合、 单克隆抗体
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
提问：
植物细胞工程常用的技术手段有哪些？
植物组织培养, 植物体细胞杂交
动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
动物细胞培养的原理：细胞增殖
过程：
一、动物细胞培养：
动物细胞的培养过程
幼龄动物
取动物器官
和组织
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养
单个细胞
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
胰蛋白酶
剪碎
单个细胞
加培养液
制成
细胞悬浮液
细胞株
细胞系
细胞增殖
无限传代
去掉组织间蛋白质
动物细胞培养不能
最终培养成生物体
思考题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？
４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？
５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？
没有
是
成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖
先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理
胰蛋白酶水解蛋白质
细胞间的成份是蛋白质
思考题
６、细胞膜的主要成份是什么？
７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？
８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？
９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？
蛋白质和磷脂
能
注意时间的控制
不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近
胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛
思考题
11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？
12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？
13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？
易于培养细胞贴壁，进行生长增殖
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。
将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。
这样的过程叫做传代培养
思考题
14、如何理解原代培养和传代培养？
15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？
16、有些为何能一直传下去吗？
17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？
18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？
上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
不都能
发生突变，朝着癌细胞方向发展
不是
保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展
1、选材：
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。
在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
2.分散成单个细胞
3.动物细胞生长特性：
细胞贴壁：
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，
称为细胞贴壁。
要求：
培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
4.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？
多数组织细胞固定在表面生长和分裂。
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
遗传物质改变
动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境
（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、营养
（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）
3、温度和pH
36.5+（-）0.5 ℃, 7.2-7.4
4、气体环境：
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
保证细胞顺利的生长增殖
植物细胞的全能性
细胞株、细胞系
植物体
培养结果
获得细胞或细胞产物
快速繁殖、培育无病毒植株等
培养目的
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
培养基特有成分
液体培养基
固体培养基
培养基性质
细胞增殖
原理
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目
植物组织培养和动物细胞培养的比较
动物细胞培养应用
大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）
作为基因工程中的受体细胞
培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性
为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据
二、动物体细胞核移植技术:
将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。
用核移植的方法得到的动物称为克隆动物
原理:动物细胞核的全能性
核移植
胚胎细胞核移植
体细胞核（难度高）
卵细胞
Ａ母绵羊
Ｂ母绵羊
乳腺细胞
细胞质
细胞核
细胞核移植
早期胚胎
卵裂
C母绵羊子宫
胚胎移植
多莉羊
分娩
妊娠
多莉羊的培育过程
融合后的卵细胞
思考题
１、核在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？
为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。
２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？
10代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型，未突变
3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？
不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞
◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？
◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？
◆激活方法：
◆激活目的：
◆促融方法：电刺激
◆胚胎移植至代孕受体内
妊娠、分娩
体细胞核移植流程图
供体：优质高产奶牛
受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）
1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。
遗传性状与供体牛完全相同吗？
克隆动物的研究意义
1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白
2.改良动物品种
3.治疗人类疾病，作为供体
4.保护濒危动物
体细胞核移植技术存在的问题：
许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。
1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 --------------------（　 ）
　　
A．细胞系 B．细胞株
C．原代细胞 D．传代细胞
2、动物细胞工程技术的基础是 ------（　）
　
A.动物细胞融合 B.单克隆抗体　
C.胚胎移植 D.动物细胞培养
A
D
3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （　 ）
　　
A.容易产生各种变异 B．具有更强的全能性
　 C.取材十分方便 　　 D．分裂增殖的能力强
D
4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于------------------------------（ ）
A.培养基不同；
B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；
C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；
D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培
养成植株。
A
三、动物细胞融合
1、诱导方式
物理法
化学法
生物法：
灭活的病毒
仙台病毒
紫外线
丧失感染性
（不感染细胞）
保留融合活性
（诱导细胞融合）
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿通
细胞膜连接
细胞融合，形成杂种细胞
（原理：细胞膜的流动性）
2、过程：
主要用于制备
单克隆抗体
获得杂种植株
用途
物理、化学方法
（同左）
灭活的病毒
物理（离心、振动、电刺激）
化学（聚乙二醇）
诱导方法
使细胞分散后诱
导细胞融合
去除细胞壁后诱
导原生质体融合
细胞融合的方法
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性、
植物细胞全能性
原理
动物细胞融合
植物体细胞杂交
比较项目
3、植物、动物细胞融合的比较
特异性免疫
（第三道防线）
细胞免疫
体液免疫
抗体
B淋巴细胞
直接接触靶细胞
T淋巴细胞
特点：出生后产生，只对一种或一类病原体或
异物起作用。
B、T淋巴细胞的起源
骨髓中造血干细胞
胸腺中
骨髓
T淋巴细胞
B淋巴细胞
分化
分化
仍在
随血液进
分裂
分裂
抗原与抗体
A、抗原
概念： 能够引起机体产生特异性免疫反应的物质
举例：病原体，花粉，癌变的细胞,部分异型细胞
特点：异物性
大分子性
特异性（具有抗原决定簇）
B、抗体
概念： 机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白
化学本质：蛋白质
产生细胞：效应B细胞（浆细胞）
分布：血清、组织液、外分泌液（eg:乳汁）
当堂训练
体液免疫
抗原
吞噬细胞
(摄取、处理)
T淋巴细胞
B淋巴细胞
传递
呈递
直接刺激
记忆B细胞
增殖分化
浆细胞
合成分泌
抗体
（特异性免疫反应）
二次应答
细胞免疫
抗原
吞噬细胞
(摄取、处理)
T淋巴细胞
呈递
增殖分化
记忆T细胞
效应T细胞
靶细胞
(被抗原入侵的宿主细胞)
密切接触
二次应答
四、单克隆抗体
1.其由何种细胞产生？
2.主要分布在哪里？
3.如何得到抗体？
？
抗体
1。抗原 动物体内
刺激
效应B
抗原 动物体内
刺激
效应B
抗体
抗原不纯
抗体不纯
筛选单一效应B细胞
不能增值产生大量抗体
2。特异性差、纯度低；
产量低、反应不够灵敏
普通制备抗体的过程
单克隆抗体
设计方案：
一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体
小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
-化学性质单一、特异性强的抗体。
杂种细胞
单克隆抗体制备过程
注射抗原
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
筛选，继续培养
足够数量的、能产生特定抗体的细胞群
体外培养
注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
？
？
诱导其融合的方法有哪些？
抗原
效应
B细胞
单克隆抗体
制备过程：
思考：
1、本过程利用了哪些技术和原理？
动物细胞融合和动物细胞培养；
细胞膜的流动性和细胞增殖。
2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？
这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体
B BB B瘤 瘤瘤 瘤
细胞融合后培养液中有几种细胞
筛选杂种细胞
已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两条DNA合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加PEG促融，获得杂种细胞。
除通过杂交瘤细胞产生单克隆抗体外，还有什么方法？
3.单克隆抗体的应用：
①在基础理论研究中具有重要意义
②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有
特异性高、灵敏度高等优越性。
③生物导弹
小结
1.三种融合细胞
2.两次 筛选
3.两种技术
4.两个原理
5.杂交瘤细胞两个特点
6.两种生产方法
7.单抗两个优点
总结
一种诱导细胞融合的新方法
一种新细胞
灭活病毒
杂交瘤细胞
一个优势
单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势
科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓疤细胞融合的是（ ） 　
A.经过免疫的B淋巴细胞
B.没经过免疫的T淋巴细胞
C.经过免疫的T淋巴细胞
D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞
A
2..动物细胞融合的目的中最重要的是----------------（ ）
A.克服远缘杂交不亲和 B. 制备单克隆抗体
C.培育新品种 D.生产杂种细胞
3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）
诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段基本相同
C. 所采用的原理完全相同 D. 都能形成杂种细胞
B
D
4. 单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是------（ ）
A.由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合
B.由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成
C.由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成
D.由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成
D
5.上图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。
( l ) 技术是单克隆抗体技术的基础。
( 2 )根据培养基的用途分类，图中 HAT 培养基属于 培养基，目的是
。在培养的过程中需要添加无机盐，但要注意营养物的 ，以保证生命活动的正常进行。
( 3 )单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是 。
( 4 )动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用 。
( 5 )选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 特点，又具备淋巴细胞的 特点。
( 6 )淋巴细胞是由动物体 中的 细胞分化、发育而来。
( 7 )杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是 。
（8）若用15N标记的氨基酸培养能产生单克隆抗体的细胞，放射性物质在细胞结构中出现的先后顺序是 。
动物细胞培养
选择性
筛选出杂交瘤细胞
种类和数量
特异性强，灵敏度高
灭活的病毒
分泌特异性抗体
在体外大量增殖
骨髓
造血干
主动运输
核糖体 内质网 高尔基体 细胞膜
6.
下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案
2、该方案能达到预期效果吗？为什么？
4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。
1、该实验方案的目的是__________
3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______
5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。
制备单克隆抗体
B细胞
抗体
细胞融合
灭活病毒
双亲细胞
分泌抗体
无限增殖
原代
传代
50
B
体外培养
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
足够数量的细胞群
注射到
小鼠腹腔
A
C
7.世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：
黑面绵羊去
核卵细胞
白面绵羊卵
腺细胞核
重组细胞
早期胚胎
另一头母绵羊子宫
克隆绵羊多莉
a
b
电脉冲处理
妊娠、出生
⑴写出 ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ　　ｂ　　。
⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是： 。
⑶多莉面部的毛色是 ，判断依据： 。
⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞核也具有 。
⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义： 。
（1）动物体细胞核移植、胚胎移植
（2）卵细胞的细胞质为核基因的表达提供必需的营养和环境条件
（3）白色、多莉的核DNA全部来自白色的亲代绵羊
（4）全能性
（5）提高绵羊的产毛量产奶量、转基因绵羊可以作为药用蛋白的生物反应器

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