资源简介

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第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程
——植物细胞工程的基本技术
目录
CONTENTS
植物组织培养技术
植物体细胞杂交技术
细胞工程的概念及发展历程
细胞工程的概念及发展历程
01
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
动物细胞工程
植物细胞工程
原理
操作水平
目的
植物组织培养
植物体细胞杂交
细胞工程的概述
哈伯兰特提出细胞全能性的理论，但相关实验尝试没有成功。
斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
植物细胞工程的发展历程
1902年
1958年
1960年
1964年
1971年
1974年
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
动物细胞工程的发展历程
植物组织培养技术
02
咏怀
兰为王者香，芬馥清风里。
从来岩穴姿，不竞繁华美。
思考：高洁、典雅的兰花颇受人喜欢。但其繁殖率低，价格不菲，如何让它大量、快速地繁殖呢？
植物组织培养技术
是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
外植体
植物细胞的全能性
原理
生殖方式
无性生殖
分裂方式
有丝分裂
1、植物组织培养
2、细胞全能性
每一个细胞含有控制该生物发育的全部基因
原因
（1）受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞
（2）植物细胞＞动物细胞
比较
生物体内细胞并不都表现全能性
原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达
必修1-P121——细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。
体现全能性的标志
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能
——如何才能让细胞表现出全能性？
叶子
花瓣
花粉
细胞
植物体
细胞的全能性
播种
扦插
一般情况下：
一定条件下：
离体
一定的营养物质
植物激素
适宜的温度、pH
无菌等外界条件
外植体
愈伤组织
试管苗
完整植株
脱分化
芽、根等
再分化
生长 发育
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
分化状态
未分化状态
用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。
3、方法步骤
外植体
愈伤组织
试管苗
完整植株
脱分化
芽、根等
再分化
生长 发育
分化状态
未分化状态
菊花的组织培养
脱分化：在一定的 和 等条件的 下，使 的细胞 ，转变成 的过程。
激素
营养
诱导
已经分化
失去其特有的结构和功能
未分化的细胞
①光照条件：
②过程中涉及的生命活动：
一般不需要光照
只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化
光照以后往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
外植体脱分化的难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而不同。一般来说，植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶等成熟的组织脱分化则较难。
外植体
愈伤组织
试管苗
完整植株
脱分化
芽、根等
再分化
生长 发育
分化状态
未分化状态
菊花的组织培养
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已分化的细胞失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞,进而形成不定形的薄壁组织团块。
再分化是指产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。。
①实质：
基因的选择性表达
②光照条件：
需要给予适当强度的光照
诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。
外植体
愈伤组织
试管苗
完整植株
脱分化
芽、根等
再分化
生长 发育
分化状态
未分化状态
菊花的组织培养
过程中涉及的生命活动：
既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。
结果：再分化形成胚状体、芽、根等。
离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
菊花的组织培养
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
1、外植体的消毒
菊花的组织培养
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
2、外植体的切段
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
1、外植体的消毒
为什么全程都要无菌操作？
防止微生物生长。
a.一方面防止杂菌与培养物竞争营养；
b.另一方面产生有害物质危害培养物。
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插！
（将“形态学上端”朝上，下端朝下）
3、接种外植体
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
4、诱导愈伤组织
培养条件：
①激素比例1：1；
②一般不需要光照；
③温度18---22℃ 。
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
5、诱导生芽生根
注意：先诱导生芽，再诱导生根！
生芽过程：
生根过程：
将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上（含细胞分裂素比例多），需光照。
再将其转接到诱导生根的培养基上（含生长素比例多），需光照。
使用比例 实验结果
生长素
细胞分裂素
>
生长素
细胞分裂素
<
生长素
细胞分裂素
＝
促进根的分化
促进芽的分化
促进愈伤组织的形成
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
5、诱导生芽生根
注意：先诱导生芽，再诱导生根！
生芽过程：
生根过程：
将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上（含细胞分裂素比例多），需光照。
再将其转接到诱导生根的培养基上（含生长素比例多），需光照。
使用顺序 实验结果
先生长素后细胞分裂素 有利于细胞分裂，不分化
先细胞分裂素后生长素 既分裂也分化
同时使用 分化频率高
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
移栽
6、移栽
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。
天然无毒矿物质，属于硅酸盐。
① 接种3~4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，试分析它们被污染的可能原因。
培养基、接种工具灭菌不彻底；
外植体消毒不彻底；
操作过程不符合无菌操作要求等。
被污染的培养基
②为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？
原因是避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物生长。
③杂菌和植物细胞之间有哪些关系？
竞争或寄生。
4、结果分析与评价
拓展：植物组织培养的两种途径
胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但经过胚胎发育过程形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
胚状体
途径
器官发生途径
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
生芽生根
或胚状体
生长发育
试管苗
（移栽到大田）
类似胚的结构
胚状体
根、芽
植物体
再分化
培养条件：①无菌②营养物质③适宜条件（温度、PH、光等）
④植物激素：
遮光
光照
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
脱分化
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞（外植体）
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键。生长素和细胞分裂素的比例和浓度会影响植物细胞的发育方向。
如：胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
排列不规则，高度液泡化，呈不定型状态的薄壁细胞
植物组织培养小结
1 选取多肉上健康、饱满的叶片。
2 用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3 平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4 叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5 待叶片晾干后移至半阴处养护。
6 约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7 叶插成功
多肉进行叶插繁殖
【从社会中来】
植物体细胞杂交技术
03
1.通过有性杂交能实现吗？为什么？
西红柿
土豆
×
不能，不同种物种间存在生殖隔离
植物体细胞杂交技术
2.有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得“番茄-马铃薯杂种植株”呢？
植物体细胞杂交技术
将不同来源的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
+
=
融合实例
我们知道，植物细胞外面有一层细胞壁，这层细胞壁阻碍着细胞间的杂交。在不损伤细胞膜的前提下，如何去除植物细胞的细胞壁？
方法：酶解法。
植物细胞去掉细胞壁，形成有活力的原生质体。
用纤维素酶和果胶酶水解。利用酶的专一性。
A细胞
A原生质体
B细胞
B原生质体
原生质体：
脱去细胞壁的细胞叫原生质体。动物细胞也可算做原生质体。
原生质层：
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。包括细胞膜，细胞质，液泡膜。
原生质层
原生质体与原生质层的区别
质壁分离的“质”指的是原生质层
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
①
①
②
③
④
⑤
⑥
①去除细胞壁
②诱导融合
物理法：
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法
高Ca2+ -高pH融合法等
思考：融合后，培养基中有几种类型的细胞？
A、B、AA、BB、AB、
多细胞融合
为什么两个细胞能融合到一起呢？
融合原理：细胞膜具有流动性
1、过程
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
①
①
②
③
④
⑤
⑥
①去除细胞壁
②诱导融合
物理法：
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法
高Ca2+ -高pH融合法等
③杂种细胞壁再生
标志着植物细胞融合完成
植物细胞融合
参与此过程中的主要细胞器是？
高尔基体
杂种细胞的染色体数是多少？
杂种细胞染色体组数是多少？
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
原理：细胞膜的流动性
1、过程
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
①
①
②
③
④
⑤
⑥
①去除细胞壁
②诱导融合
物理法：
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法
高Ca2+ -高pH融合法等
③细胞壁再生
④脱分化
⑤再分化
⑥移栽
植物细胞融合
植物组织培养
植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
植物体细胞杂交的意义：
打破了生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育植物新品种。
植物体细胞杂交技术
1、过程
标志着植物体细胞杂交完成
+
=
白菜
甘蓝
白菜-甘蓝
1.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）体细胞杂交所得植株
白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
36
（异源）四
2.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）进行杂交（相互授粉），
所得植株白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
（异源）二
18
基因重组
染色体数目变异
思考与练习
项目 体细胞杂交 P1：2n(Aabb) 与 P2：2m(ccDd)
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
植物体细胞杂交后代的遗传变化
无性繁殖，育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和。2n+2m
两亲本染色体组数之和。2+2
两亲本基因型之和。AabbccDd
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
主要原因是∶生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
易错点拨
(1)误认为植物体细胞杂交的结果只是形成杂种细胞。植物体细胞杂交的结果最终要经过组织培养形成杂种植株。
(2)误认为植物体细胞杂交属于有性生殖。
植物体细胞杂交过程中没有有性生殖细胞的结合，因此不属于有性生殖，应为无性生殖。
(3)误认为杂种植株的变异类型属于基因重组。
杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，属于异源多倍体，所以变异类型为染色体变异。
归纳拓展
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
变异类型
植物组织培养
原生质体融合
原理
育种类型
原理
过程
花药离体培养
细胞全能性
操作步骤
脱分化
再分化
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞工程
优缺点
巩固练习
04
1.(2022·重庆市高二期末)某课外活动小组获得了一株性状优良的结球生菜，并利用植物组织培养技术对其进行快速繁殖。下列叙述正确的是
A.外植体消毒的过程：酒精消毒30 s→次氯酸钠溶液处理30 min→无菌水清洗
2～3次
B.愈伤组织是一种不定形的薄壁组织团块，诱导产生愈伤组织时每日应给予
适时光照
C.诱导生芽的培养基与诱导生根的培养基相比，前者中细胞分裂素所占的比
例和用量更高
D.打开封口膜后直接用流水冲洗掉幼苗根部培养基，再移植到消毒的蛭石环
境中炼苗处理
√
2.(2022·北京延庆高二期中)下图为用取自基因型为AaBb的胡萝卜韧皮部细胞培育出胡萝卜小苗的过程，下列叙述中不正确的是
A.a→b过程是通过细胞有丝分裂完成的
B.b→c→d过程发生了细胞分化
C.a→b过程中使用的培养基中应含有机碳源和氮源
D.杂合植株经上述过程获得的幼苗会出现性状分离
√
3、玉米是一种主要的农作物，为了提高玉米的产量，科学家在玉米育种和栽培中作了大量的研究。如图是关于玉米培养的过程，据图判断下列说法中错误的是(　　)
从繁殖原理上分析，A→D属于无性生殖
植株D和G中的染色体组数不同
E→G不能体现细胞的全能性
E→F过程中获得的植株一般不用于大田生产
4.如图为植物体细胞杂交技术的流程图，其中甲和乙分别表示两种二倍体植物细胞，所含有的染色体组分别是 AA 和 BB。据图分析，下列叙述正确的是
A.经过程①获得的 a、b 称为原生质体，
过程②利用了细胞膜的流动性
B.c 细胞只有 AABB 这一种类型
C.过程③和④分别是脱分化和再分化
D.获得的植物 d，即使在减数分裂时同源染色体能正常配对，在理论
上也是不可育的
√
5．自然条件下兰花杂交后代不易萌发。科研人员用四倍体品种绿宝石和二倍体品种春剑进行杂交，获得大量优质杂交兰，并对其进行染色体观察与计数，培育过程如图。下列分析不正确的是
A．调整培养基中植物激素的配比可影响原球茎的分裂与分化
B．春剑和绿宝石两个品种之间不存在生殖隔离
C．所得杂交兰植株的体细胞染色体数目为60条
D．通过植物组织培养技术从杂种胚繁殖得到的大量杂交兰性状可能不一致
√
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