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(共14张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
PCR
PCR扩增仪
PCR技术：PCR是__________________的缩写，是一项根据________________
的原理，在______提供参与DNA复制的__________与____________，对_______________________进行___________的技术；
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
特异性地快速扩增目的基因
PCR概念
原理
操作环境
目的
优点：
DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
子链延伸
子链延伸
PCR条件
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
PCR条件
PCR演示
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR过程
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
PCR过程
思考：2. PCR技术最终哪部分被大量复制了？
引物对之间的部分
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
思考：3. PCR引物设计应遵循哪些原则？
引物自身及引物之间不应存在互补序列等
思考：4.一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中等长链DNA分子数为：________个
②复制过程中共需引物__________个
2n-2n
2n＋1 - 2
PCR过程
知识归类
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
【检测】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　)
A. 8个 B. 6个 C. 4个 D. 2个
A
11年江苏高考题 请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
15/16
三
从理论上推测，第四轮循环产物中同时含有引物A和B的DNA片段所占的比例为 。
14/16
DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链（含引物A或引物B），（2n－2）个DNA都含有子链（含有引物A和引物B）。第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，其中2个DNA含有引物A或引物B，14个DNA含有引物A和引物B，占14/16。
11年江苏高考题 请回答基因工程方面的有关问题：
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。
某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由
①第1组： ；
②第2组： 。
引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物I'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
11年江苏高考题 请回答基因工程方面的有关问题：
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为______________________________________________________ 。
DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
11年北京卷节选
从图中ABCD四种单链DNA片段中选取 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。
B、C

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