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第一章 发酵工程
第1.2.2节
微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
◆聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
一、选择培养基
美国黄石公园
◆1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
◆筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2.筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
一、选择培养基
3.实验室中微生物筛选的原理
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
4.选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
一、选择培养基
5.常见的选择培养基
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤加石油
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
思考·讨论
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
尿素的分子模型
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
分解尿素的细菌
氮源
——配制以尿素为唯一氮源的培养基，将尿素分解菌筛选出来
典例1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先
调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入
尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的
能力
√
二、微生物的选择培养
二、微生物的选择培养
1、方法
2、方法步骤
对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
①铲取图样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
二、微生物的选择培养
2、方法步骤
③取0.1mL 菌液滴加到培养基表面。
1×107
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④⑤步骤为涂布器灭菌
2、方法步骤
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
2、方法步骤
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落（是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体）。
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
3、培养与观察
三、微生物的数量测定
三、微生物的数量测定
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
三、微生物的数量测定
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
②计数原则:
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
典例2.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233
√
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
典例1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
③计算公式：
三、微生物的数量测定
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
典例2：某同学在三种稀释度下取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板 稀释度　　　 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示　105的稀释度下取0.1 mL菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300范围内，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
拓展延伸
比较稀释涂布平板法和平板划线法
稀释涂布平板法
可以计数，但操作复杂
平板划线法
不可计数
3.油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是
A.图中①～③的过程为梯度稀释
B.在培养基中加入油烟污染物，
其作用是为微生物提供碳源和能源
C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质
D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数
√
4.(2022·黑龙江鸡西高二期末)如图为选育高产β-胡萝卜素的布拉霉菌的过程。随β-胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。未突变菌不能在含有β-紫罗酮的培养基上生长。下列有关叙述错误的是
A.过程①属于诱变育种
B.过程②可采用平板划
线法接种
C.过程③应选择黄色菌株进行富集培养
D.培养基中添加β-紫罗酮起选择作用
√
9.筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
下列有关本实验的叙述，错误的是
A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B.筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
√
三、微生物的数量测定
不能区分死菌与活菌
2.直接计数 —计数板计数法
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
四、探究·实践——土壤中分解
尿素的细菌的分离与计数
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
1.培养基的制备
②配方：
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
四、实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
对照组1：牛肉膏蛋白胨培养基（判断选择培养基是否具有选择作用）
对照组2：不接种的选择培养基（判断选择培养基灭菌是否充分）
2.实验设计
四、实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
（1）土壤取样
2.实验设计
四、实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（2）样品的稀释
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考
2.实验设计
四、实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。）
2.实验设计
四、实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
pH升高，酚红指示剂变红
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
补充拓展：土壤中尿素分解菌的鉴定
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
5.(2022·四川遂宁高二期中)地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。研究者从牛的瘤胃中筛选产生纤维素酶的纤维素分解菌，其筛选过程如图1所示。将丙中的菌悬液转接于含有纤维素作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用刚果红处理，看到如图2所示情况。下列有关叙述正确的是
A.甲试管中的液体是液体培养基，作用是富集培养，②过程是为了筛选单菌落
B.Ⅰ号培养基属于选择培养基，除需加入纤维素外，还需加入硝酸铵为
其提供氮源
C.Ⅱ号培养基属于固体培养基，制备时应先灭菌再调节pH
D.可挑取图2中周围不出现透明圈的菌落，用平板划线法继续纯化
√

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