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第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
（1）提 取
普通大肠杆菌
(不能分泌胰岛素)
人体组织细胞
胰岛素基因
（2）与运载体DNA拼接
（3）导入
大肠杆菌(含胰岛素基因)
（4）转基因大肠杆菌
(能分泌胰岛素)
培育转基因大肠杆菌一般需要哪些步骤？
第一步：目的基因的筛选与获取
第二步：基因表达载体的构建
第三步：将目的基因导入受体细胞
第四步：目的基因的检测与鉴定
第一步：目的基因的筛选与获取
什么是目的基因？
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
指能够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业所需酶相关的基因，等
目前被广泛提取使用的目的基因有：
苏云金杆菌抗虫基因（Bt基因）、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
如：苏云金杆菌产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），由Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）决定的，可杀死棉铃虫。通过将Bt基因转到棉花内，让棉花产生Bt抗虫蛋白来抵抗虫害。
问：抗虫棉产生的Bt抗虫蛋白对人畜有毒害么？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现毒性，且Bt抗虫蛋白被分解为多肽并与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，才能杀死害虫。而人畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此不会对人畜产生影响。
如何筛选目的基因？
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
如何获取目的基因？
如：苏云金杆菌的杀虫作用与Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）有关，科学家已掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白的功能深入了解。
阅读教材P77-79,找出获取目的基因的方法
利用PCR获取和扩增
基因文库中获取目的基因
人工合成
早期培育转基因抗虫棉时，人工合成目的基因
什么是PCR？
PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。
PCR利用的原理是什么？
DNA半保留复制
DNA复制的基本条件：
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
PCR的条件：
①DNA模板（需含有目的基因）。
②分别与模板DNA相结合的2种引物。
③四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
⑥能严格控制温度的温控设备。
引物是一段长度为20-30个核苷酸的能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
PCR的前提：
dATP
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR的过程是怎样进行的？
2.复性（退火）
引物与模板结合（55-60℃）
3.延伸
双链合成（70-75℃）
1.变性
DNA双链 单链（90-95℃）
子链延伸方向：从5’端到3’端延伸
如何鉴定PCR的产物？
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。
以指数方式扩增，即2n
（n为扩增循环的次数）
PCR的结果：
凝胶电泳原理与结果图
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 主要在细胞核内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3'端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 解旋酶、DNA聚合酶等
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 DNA在高温下变性解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中
产物 扩增特定的DNA片段或基因 合成整个DNA分子
循环次数 PCR一般要经历30多次循环 与细胞分裂同步
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 PCR技术与细胞内DNA复制的比较
第二步：基因表达载体的构建
为什么要构建基因表达载体？（基因表达载体构建的目的）
使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
（转基因的核心工作）
不能。因为目的基因是一个DNA片段，没有复制原点，不含启动子、终止子。
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便么？如果这样做，效果会怎样？
所有的DNA导入细胞的话，基本上是不会表达的，尤其是链状DNA。所有的DNA太多了，会对目的基因表达产生影响。
可能情况有很多：1、受体细胞把DNA当成外源物质降解；2、DNA进入受体细胞后，周围的离子浓度、渗透等条件与原细胞并不一致，DNA自解体了；3、质粒的话，是有可能表达的；4、DNA依然存在，可能表达，一般不表达；5、DNA整合到受体基因中，表不表达看情况。 要表达的前提是DNA在受体细胞中能存在，但存在不一定表达，还需要启动子、原料等很多条件。
作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务么？
基因表达载体由哪些部分组成？
目的基因、标记基因、启动子、终止子
功能：它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止
目的基因
启动子
位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA（基因转录的开始）
终止子
位置：基因的下游
标记基因：检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。
(一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因)
复制原点：DNA聚合酶结合位点，使目的基因复制和传递
控制特定性状或表达特定产物。
是一段有特殊序列结构的DNA片段
是一段有特殊序列结构的DNA片段
1.启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
思考
2.如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？（以四环素抗性基因为例）
基因表达载体构建过程：
一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。
形成一个重组质粒会形成多少个磷酸二酯键？
四个
基因表达载体构建模式图
第三步：将目的基因导入受体细胞
阅读教材P80-81和P88,找出相应的方法
将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？
针对不同的受体细胞，选用不同的方法。
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞（大肠杆菌、土壤农杆菌等）
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
感受态细胞：用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态。然后再将重组的基因表达载体导入其中。
目的基因导入受体细胞方法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内稳定存在和表达的过程。
(采用最多)
(受精卵)
花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助 进入受体细胞。
花粉管通道
花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。
农杆菌转化法
农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。
农杆菌转化法的原理是什么？
根据农杆菌的特点，将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入细胞。
农杆菌转化法适用于那些植物？
农杆菌转化法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
方法步骤：
插入Ti质粒的 上→转入 →导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
目的基因
T-DNA
农杆菌
据图可知，目的基因发生了几次剪切和拼接？重组Ti质粒跨越了几层细胞膜？
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
第四步：目的基因的检测与鉴定
是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
是否可以确定得到了新的性状？
是否可以确定转基因就成功了呢？
不一定！
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
阅读教材P82,找出检测和鉴定的方法
从哪些方面进行目的基因的检测与鉴定？
分子水平的检测
①检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；
③检测目的基因是否翻译成对应蛋白质等。
还需要进行个体生物学水平的鉴定
1.分子水平的检测
(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中： 技术。
DNA分子杂交或PCR等
用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。
基因探针：
单链DNA或RNA片断，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。
简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂）、且顺序已知的、与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
(2)检测目的基因是否转录： 技术。
将转基因生物提取出来的 和基因探针进行杂交，如果出现 ，说明目的基因已经转录。
分子杂交或PCR
mRNA
杂交带
(3)检测目的基因是否翻译出蛋白质： 技术。
从转基因生物提取出来的 和 进行杂交，如果出现 ，说明目的基因已经翻译。
抗原—抗体杂交
蛋白质
相应的抗体
杂交带
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
2.个体水平的鉴定
(1) 的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行 。
抗虫或抗病
活性比较
目的基因的检测与鉴定归纳
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA片段扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
3.PCR 产物的鉴定
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
目的要求
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
材料用具
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
方法步骤
1.用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
2.待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
3.参照右表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
4.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
8.将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
10.取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时， 停止电泳。
实验结果

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