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第38讲　微生物的培养与应用
人教(2019)生物高考复习
课标考情——知考向 课标 要求 1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提
2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术
3．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物
4．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法
5．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法
核心素养——提考能 科学思维 通过分析培养基的成分及作用，归纳平板划线法与稀释涂布平板法的异同
科学探究 能够按照要求设计分离微生物的实验
社会责任 关注有害微生物的控制、宣传健康生活
自 主 学 习 · 巩 固 基 础
[自主学习]
知识点一　微生物的实验室培养
1．培养基
【答案】氮源　无机盐　液体培养基　鉴别培养基　pH　氧气
2．无菌技术

【答案】巴氏消毒法　干热灭菌　湿热灭菌　外来杂菌
3．酵母菌的纯培养
(1)纯培养：在微生物学中，将接种于__________内，在合适条件下形成的____________________的群体称为培养物。由______________ 所获得的微生物群体称为纯培养物，获得_____________的过程就是纯培养。
培养基　
含特定种类微生物　
单一个体繁殖　
纯培养物　
(2)纯培养过程。
【答案】(2)琼脂　蒸馏水　干热灭菌箱　50 ℃　酒精灯火焰　单　恒温培养箱
[自主检测]
1．思考判断
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 (　　)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。 (　　)
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。 (　　)
(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 (　　)
(5)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧。 (　　)
【答案】(1)√　(2)×　(3)√　(4)×　(5)√
2．深挖教材
(1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？__________________________。
(2)微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？____________________________。
(3)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？____________________________。
(4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
__________________________________________________。
(5)平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？目的是什么？
____________________________________________________。
【答案】(1)提示：还能有效避免操作者自身被微生物感染
(2)提示：不是。微生物的接种技术还包括斜面接种，穿刺接种等方法。其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度
(3)提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
(4)提示：不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染
(5)提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散以便获得单个菌落
3．热图导析
如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，据图分析下列问题。
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是___________。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是__________，为避免此种现象应当采取的措施是__________________________。
(3)接种操作一定要在火焰附近进行是因为__________________。
【答案】提示：(1)稀释涂布平板法、平板划线法　(2)菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌　增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌　(3)火焰附近存在着无菌区域
[自主学习]
知识点二　土壤中分解尿素的细菌的分离
【答案】酚红　样品稀释　培养观察　以尿素为唯一氮源　稀释涂布平板法
[自主检测]
1．思考判断
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 (　　)
(2)从物理性质的角度看，选择培养基多属于液体培养基。 (　　)
(3)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 (　　)
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 (　　)
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。 (　　)
(6)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。 (　　)
【答案】(1)×　(2)×　(3)√　(4)√　(5)×　(6)×
2．深挖教材
(1)想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
______________________________________________________。
(2)细菌数目的测定还有哪些方法？举例说明：
_______________________________________________________。
(3)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？
______________________________________________________。
【答案】(1)提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按公式每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M进行计算
(2)提示：滤膜法。测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法
(3)提示：由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量
重 难 探 究 · 素 养 达 标
微生物的实验室培养
1．培养基中的营养成分
培养基一般都含有水、无机盐、碳源和氮源等营养物质，此外，还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
[深度讲解]
营养要素 来源 功能
碳源 无机碳源 CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物 ①构成细胞中的物质和一些代谢产物；
②有些既是碳源又是能源
有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等 氮源 无机氮源 NH3、铵盐、硝酸盐、N2等 将无机氮合成含氮有机物
有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸及含氮的有机物
2．培养基的种类及应用
划分标准 培养基种类 特点 应用
按物 理性 质分 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
半固体培养基 加凝固剂 (如琼脂) 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基 微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保存
划分标准 培养基种类 特点 应用
按用 途分 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；以尿素为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌)
划分标准 培养基种类 特点 应用
按用 途分 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物(如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水中是否有大肠杆菌)
按化 学成 分分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确 分类、鉴别
3．平板划线法和稀释涂布平板法的比较
(一)考查微生物的营养成分(素养目标：生命观念)
1．回答下列有关微生物培养的问题：
(1)如表是某培养液成分含量表，该培养液培养的微生物的同化作用类型是__________；若用此培养液培养固氮微生物，则应除去的成分是__________________，应加入的物质是__________。
[考向预测]
编号 成分 含量
① (NH4)HCO3 0.5 g
② KH2PO4 3.0 g
③ CaSO4 0.5 g
④ FeCl2 0.5 g
⑤ 维生素 少许
⑥ 水 1 000 mL
(2)下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答：
成分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O
含量 0.5 g 1 g 0.5 g 100 mL
①牛肉膏、蛋白胨在培养基中的作用是提供___________、__________、__________等营养物质。
②要用表中所给材料配制观察细菌菌落状况的培养基，还需添加的成分是__________。
③表中各成分含量确定的依据是___________________________。
④培养基配制好后，分装前应进行的工作是__________________。
⑤从配制培养基直到培养完成，所采用的预防杂菌污染的方法是____________、____________、____________等。
(3)微生物接种的方法很多，最常用的是________________________和__________________。
【答案】(1)自养型　(NH4)HCO3(或①)　有机物　(2)①碳源　氮源　维生素(或磷酸盐等)　②琼脂(或凝固剂)　③所培养微生物对各营养成分的需求量　④调节pH　⑤高压蒸汽灭菌　灼烧接种环　酒精棉擦手(或棉塞塞试管口、在火焰旁接种)　(3)平板划线法　稀释涂布平板法
(二)考查微生物的纯化培养(素养目标：生命观念)
2．(2021年沙坪坝重庆八中期中)某兴趣小组试图从土壤中分离某种细菌，流程图如图所示。如表所示配方的培养基可筛选某种细菌，该细菌可以在该培养基上生长，进而形成菌落。回答下列问题：
KH2PO4　1.4g
Na2HPO4　2.1 g
MgSO4·7H2O　0.2 g
葡萄糖　10.0 g
尿素　1.0 g
琼脂　15 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL
(1)该培养基可筛选的细菌是__________________，判断的依据是__________________。
(2)如果从土壤中获取的样本含该细菌的数量较少，需要对样本中的细菌进行扩大培养，请判断能否用表格中的培养基来扩大培养________ (填“能”或“不能”)，理由是__________________。
(3)如果需要对该细菌进行计数，则应用____________法接种。接种尿素分解菌后的培养基需要倒置培养，原因是__________________。
(4)从第二次稀释开始，分别取1 ml菌液加入________ml无菌水逐步稀释10倍后，三个培养皿中分别形成了54、46、50个菌落，则1 g土壤样本中的活菌数为__________个。
(5)为了确定该细菌确实属于所要分离的细菌，需要在培养基中加入__________指示剂。培养该细菌后，因pH升高，指示剂将变红。
【答案】(1)分解尿素的细菌　培养基中尿素是唯一的氮源　(2)不能　扩大培养应该用液体培养基，表格中配方含有琼脂，是固体培养基　(3)稀释涂布平板　防止培养皿盖上的水滴落造成培养基的污染　(4)9　5×107　(5)酚红
【解析】(1)根据表格分析可知，该培养基中只有尿素一种氮源，因此该培养基可以用于筛选能分解尿素的细菌。(2)根据以上分析已知，该培养基是固体培养基，而菌种的扩大培养需要用液体培养基，所以该培养基不能用来扩大培养尿素分解菌。(3)微生物接种的常用方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可以对微生物进行计数。接种分解尿素的细菌后的培养基需要倒置培养，可以防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基中造成污染。(4)对培养液进行稀释时，应取1 mL菌液加入9 mL无菌水中即稀释10倍，如图所示，1 g土壤样本共稀释106倍，三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌数目为(54＋46＋50)÷3×106＝5×107个。
微生物的分离与计数
1．分离和鉴定分解尿素细菌的方法
[深度讲解]
项目 详解
土壤采样 采集的土壤应该选择含有尿素的土壤
选择培养 选择土样，将土样放在含有尿素作为唯一氮源的培养基上进行选择培养
梯度稀释 选用一定稀释范围的样品液进行培养以保证菌落数在30～300
鉴定方法 加入酚红指示剂，若指示剂变红，说明该种菌能分解尿素
2．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)。
(2)改变培养基的营养成分。

(3)利用培养基“特定化学成分”分离。

(4)通过某些“特殊环境”分离。
3．统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法。
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
②缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作：
a．设置重复组，增强实验的说服力及准确性。
b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 之间的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目小。这是因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
微生物筛选的基本过程(素养目标：科学探究)
(2021年云南师大附中高三月考)研究者欲从土壤中筛选尿素分解菌，相关实验流程如图所示。
[考向预测]
回答下列问题：
(1)本实验中将用到的玻璃和金属材质的实验器具__________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)本实验所用培养基都应以__________为唯一氮源，其中培养基甲能选择出分解尿素的细菌的原因是____________________________。
(3)图中利用培养基乙进行分解尿素的细菌的鉴定时，所用的接种方法为__________________。培养基中应添加__________指示剂，其鉴别原理是__________________________。
【答案】(1)可以　(2)尿素　分解尿素的细菌能利用尿素为氮源，能正常地生长繁殖，而其他微生物不能利用尿素为氮源，生长繁殖受抑制　(3)稀释涂布平板法　酚红　分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基中碱性增强，酚红指示剂变红

【解析】(1)干热灭菌可以对玻璃和金属材质的实验器具进行灭菌。(2)可以用以尿素为唯一氮源的培养基，筛选能分解尿素的细菌。因为分解尿素的细菌能利用尿素为氮源，能正常地生长繁殖，而其他微生物不能利用尿素为氮源，生长繁殖受抑制。(3)根据题干中的图示可知，用培养基乙进行分解尿素的细菌的鉴定时，所用的接种方法为稀释涂布平板法。分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基中碱性增强，酚红指示剂变红，故可以向培养基中添加酚红指示剂来进一步鉴定分解尿素的细菌。
典 题 演 练 · 破 解 高 考
1．(2021年广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为________________，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用____________________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有__________________________等。(答出两种方法即可)
(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是______________ _________________________________________。(答出两点即可)
(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中__________可能是高密度培养的限制因素。
(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌____________________________________。
【答案】(1)唯一碳源　血细胞计数板计数　诱变育种、基因工程育种　(2)盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制　(3)氧气(O2或溶解氧)　(4)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
【解析】(1)根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源，并不断提高其浓度，经多次传代培养以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用血细胞计数板计数的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。(2)已知菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60 g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60 d以上，而盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。
(3)分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件下适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气(O2或溶解氧)是限制高密度培养的重要因素。(4)根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
名师点睛
测定微生物数量的方法：(1)直接计数法：常用显微镜直接技术法，一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。(2)间接计数法：常用稀释平板计数法，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体。
2．(2020年全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________________。甲、乙培养基均属于____________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释____________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是________________ ____________ (答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：__________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________________。
【答案】(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐　　
【解析】(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过2 00个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1 000×100÷200＝1×104。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。

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