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第2节
动物细胞工程
第2章　细胞工程
SW-PWF
第2课时
动物细胞融合技术与单克隆抗体
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
温故而知新
植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
回顾必修一：细胞膜的结构
1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图
1.概念：
使____或_____动物细胞结合形成____细胞的技术。
2.结果：
形成的________具有原来两个或多个细胞的_________。
3.原理：
与植物原生体融合的基本原理相同体现了 。
4.诱导融合的常用方法：
有 等。
一
动物细胞融合技术
两个
多个
一个
杂交细胞
遗传信息
细胞膜具有一定的流动性
电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法
5.意义：
突破了 的局限，使 成为可能。
有性杂交
远缘杂交
是动物细胞融合特有的诱导融合方法
6.过程：
一
动物细胞融合技术
动物细胞融合
动物细胞培养
7.应用：
(1)细胞融合技术已经成为研究________、_________、______和______________等的重要手段
(2)利用动物细胞融合技术发展起来的_________，为___________开辟了新途径。
AA、AB、BB
细胞遗传
细胞免疫
肿瘤
培育生物新品种
杂交瘤技术
制造单克隆抗体
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
相关信息
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
细胞核的融合
融合实质及完成的标志：
生物方法：灭活病毒诱导法
动物细胞融合和植物体细胞杂交比较
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
时间 成果
19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞
1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。
1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合
1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)
（一）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史
1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
2.抗体由什么细胞产生？
3.抗体的化学本质是什么？
4.与抗原作用的特点？
5.抗体主要分布在哪里？
主要分布在血清中。其次在组织液及外分泌液中也含有。
抗体是机体受抗原刺激后B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞产生
具有免疫功能的球蛋白
能与该抗原发生特异性结合的
回顾旧知
抗体
体液免疫
1.传统抗体的获得
向动物体内反复注射某种抗原，从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
(2)缺点：
二
单克隆抗体及其应用
(1)方法:
产抗体，不能无限增殖。
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗原不纯
二
单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体的制备
(1)单克隆抗体的概念:
单个细胞
无性繁殖
化学性质单一，特异性强
单：
克隆：
抗体：
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
二
单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体的制备
(2)B淋巴细胞的特点:
如何获得大量、单一的抗体？
如何解决这一难题？
癌细胞能无限增殖，但不能产生抗体
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞：既能迅速大量增殖，又能产生抗体
(3)单克隆抗体的制备思路
二
单克隆抗体及其应用
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：
1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
米尔斯坦
科勒
(4)制备过程：
二
单克隆抗体及其应用
多种B细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞和B细胞融合
多种杂交细胞
诱导融合
能产生抗体，
但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
瘤-瘤、B-B、 B-瘤
注射特定的抗原
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
融合的方法？融合后，融合细胞几种类型？（只考虑两两融合）
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
第一次筛选：
用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
第二次筛选：对选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
二
单克隆抗体及其应用
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增值
←B淋巴细胞及同型融合细胞
←骨髓瘤细胞及同型融合细胞
←杂交瘤细胞
补充资料：如何进行第一次筛选获得多种杂交瘤细胞？
①已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
不能无限增殖，死亡
不能无限增殖，死亡
能无限增殖，生长
培养基中加入氨基嘌呤
HAT培养基
补充资料：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？
将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
多孔细胞培养板
阳性孔
抗体检测板
多次克隆化培养以及有限稀释法
抗原-抗体杂交(分子水平的鉴定）
抗体检测原理：
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
比较两次筛选的原因、方法和结果。
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
筛选获得杂交瘤细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用多孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞培养
杂交细胞
单一抗体
阳性细胞
单克隆
抗体
细胞融合
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
融合
筛选
克隆
抗体检测 · 筛选
脾脏中获取
单克隆抗体的制备过程利用了那些技术？
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体的制备过程利用了那些技术？
用抗原免疫小鼠
骨髓瘤细胞的培养
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
融合
多种细胞
置于选择培养基上培养
骨髓瘤细胞及同型融合细胞死亡
B淋巴细胞及同型融合细胞死亡
杂交瘤细胞
克隆化培养和抗体检测
用培养液将杂交瘤细胞群稀释
注射到小鼠体内
（体内培养）
体外培养
单克隆抗体
约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
多孔细胞培养板
(1)该过程中应用到的技术：
(2)原理：
(3)注射特定抗原的目的：
(4)诱导融合的方法：
动物细胞特有的为______________
(5)比较两次筛选的不同：
(6)杂交瘤细胞的特点：
(7)如何获取大量所需杂交瘤细胞？
(8)如何获取单克隆抗体：
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取或从小鼠腹水中获取
小结：单克隆抗体的制备
培养杂交瘤细胞的方法比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
(1)能准确地识别抗原的细微差异;
(2)与特定抗原发生特异性结合;
(3)可以大量制备。
3.单克隆抗体的优点：
二
单克隆抗体及其应用
资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
单克隆抗体的应用
思考·讨论
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
思考·讨论
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
单克隆抗体的应用
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
思考·讨论
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体的应用
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。
4.单克隆抗体的应用
(1)作诊断试剂——应用最广泛
实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
二
单克隆抗体及其应用
抗原-抗体杂交法
优点：准确、高效、简易、快速。
结合同位素的单抗
荧光标记的单抗
(2)运载药物
二
单克隆抗体及其应用
抗体-药物偶联物（ADC）通过将 与能特异性识别肿瘤抗原的 结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由_____、______和______三部分组成。
单克隆抗体
细胞毒素
抗体
接头
药物
“生物导弹”
=单克隆抗体＋放射性同位素
或＋化学药物
或＋细胞毒素
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单抗导向，药物为弹头
靶向运输作用
(3)作为药物治疗疾病
二
单克隆抗体及其应用
单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
课堂小结
①未融合的细胞②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
动物细胞融合
动物细胞培养
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是( )
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
一.概念检测
练习与应用
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是( )
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
二、拓展应用
练习与应用
补充了解——克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
补充了解——不同水平的克隆及实例
分子水平
细胞水平
个体水平
DNA复制、PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养、动物细胞核移植
细胞水平
单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？
思考
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