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(共37张PPT)
第1课时
动物细胞培养
第2节
动物细胞工程
第2章　细胞工程
SW-PWF
首例胚胎移植成功
首创动物组织体外培养法
发现哺乳动物精子获能现象
体细胞核移植成功
试管家兔诞生
创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
分离和培养小鼠胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
P33
动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
科技探索之路
动物细胞工程的部分成果
克隆猴
中中和华华
克隆皮肤
通过细胞培养构建的人造皮肤
大面积烧伤的病人,需要移植健康皮肤
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。怎样获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养可供的移植皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤，既解决了来源不足，又不会产生排斥反应。
烧伤病人图片
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
生产单克隆抗体
动物细胞工程
是最基础的技术
植物细胞工程
植物组织培养
植物体细胞杂交
细胞工程
细胞增殖(有丝分裂)。
动物细胞培养是指从动物体中_____相关的_____，将它_____________，然后在_____________下，让这些细胞____和_____的技术。
(2)目的：
(1)原理：
(3)地位：
取出
组织
分散成单个细胞
适宜的培养条件
生长
增殖
获得细胞或细胞产物(不能获得完整动物个体)。
那么，动物细胞培养需要哪些必要的条件？培养的过程又是怎样的呢？
是动物细胞工程的基础。
动物细胞培养的条件
一
动物细胞培养的条件
营养物质
其他条件
▌糖类 氨基酸无机盐 维生素
▌无菌、无毒的环境
▌适宜的温度、pH和渗透压
▌适宜的气体环境
这里的糖类不包括淀粉、蔗糖等
1.营养：
(1)合成培养基----已知成分
将细胞所需的__________（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按_____和______严格配制而成的培养基，称为_________。
营养物质
种类
所需量
合成培养基
(2)天然成分--未知成分
由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此在使用合成培养基时，通常需加入____等一些天然成分。
血清
(3)培养动物细胞一般使用__________，也称为______。
液体培养基
培养液
血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。即天然培养基。
动物细胞培养的条件
一
思考1:为什么培养液需要定期更换？
____________________________________________
思考2:如何防止培养过程中的微生物污染？
____________________________________________
一
2.无菌、无毒的环境：
(1)对培养液和所有培养用具进行_____处理
(2)在_______下进行操作；
(3)还需要______________。
灭菌
无菌环境
定期更换培养液
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
在细胞培养液中添加一定量的抗生素
脉动真空灭菌器
动物细胞培养的条件
3.温度、pH和渗透压
(1)哺乳动物细胞培养的温度多以___________为宜；
(2)多数动物细胞生存的适宜pH为________。
(3)维持适宜渗透压的目的_________________________。
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
一
动物细胞培养的条件
4.气体环境：
(1)动物细胞培养所需气体主要有____和_____。
O2：_______________________
CO2：_____________________________
(2)容器：通常采用_______或_____________。
(3)仪器：置于含有_______和______的混合气体的_____________。
O2
CO2
O2是细胞代谢所必需的
CO2的主要作用维持培养液的pH
培养皿
松盖培养瓶
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
一
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
二
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液原代培养
分瓶
传代培养
动物细胞培养的过程
二
取动物组织
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
加培养液
细胞悬液
在培养皿或培养瓶内
原代培养
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
出现接触抑制
细胞分裂受阻
解决方法
传代培养
分瓶培养
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
悬浮培养的细胞：直接用离心法收集
贴壁细胞：用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
培养过程中出现了几个概念：
要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附
(1)细胞贴壁:
动物细胞培养的过程
二
大多数体外培养的细胞需要_ _____________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的_____上。
贴附于某些基质表面
瓶壁
(2)接触抑制:
当_____细胞生长到____________时，细胞通常会__________。
贴壁
表面相互接触
停止分裂增殖
通常将_______的细胞培养，即动物组织经____后的______称为原代培养；
(3)原代培养：
(4)传代培养：
将_______的细胞培养称为传代培养。
分瓶之前
处理
初次培养
分瓶后
10代以内的细胞
10-50代的细胞
形成一层细胞
可形成多层细胞
肿瘤细胞失去接触抑制，癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少，条件适宜在培养液可以无限增殖下去。
圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）
培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）
细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）
贴壁生长与接触抑制
1.取什么样的组织？原因？
选动物胚胎或幼龄动物的器官或组织
原因：其细胞生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养。
2.为什么要分散成单个细胞？
3.用胰蛋白酶分散细胞，说明什么问题？
4.可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？
①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖;
②便于细胞从培养液中获得营养，保证细胞内的有害代谢物及时排出。
动物细胞间的物质主要是蛋白质
不可以，因为胃蛋白酶的最适pH为1.5左右，多数动物细胞生存的pH为7.2-7.4,胃蛋白酶在此环境下会失活。胰蛋白酶在此环境下活性较高。
思考·讨论:
不对；使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
5.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？
思考·讨论:
纤维蛋白、胶原蛋白等
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
6.正常细胞能否一直传代培养下去？
遗传物质改变
遗传物质有的改变
分瓶培养
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
思考·讨论:
不可以；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了；
遗传物质有的改变
7.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
思考·讨论:
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
细胞悬浮液
胰蛋白酶
原代培养
传代培养
大量细胞
单个细胞
加培养液
离体的植物器官、组织或细胞
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
接种至培养基
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点 植物组织培养和动物细胞培养的比较
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
动物胚胎、幼龄动物
机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理将组织分散成单个细胞
用培养液将细胞制成细胞悬液
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液原代培养
分瓶
传代培养
干细胞存在于_______、_____和_______等多种组织和器官中。
干细胞培养及应用
三
干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。
早期胚胎
骨髓
脐带血
1.分布:
干细胞包括___________和__________等。
干细胞培养及应用
三
2.类型:
胚胎干细胞
成体干细胞
干细胞培养及应用
三
③成果：
(1)胚胎干细胞(简称ES细胞)
①分布：存在于__________中。
②特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的 ，并进一步形成机体的所有 甚至 的潜能。
早期胚胎
细胞
组织和器官
个体
全能干细胞
④局限：
目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
胚胎干细胞必须从 中获取，这涉及 问题，因而限制了它在医学上的应用。
伦理
胚胎
干细胞培养及应用
三
③特点：成体干细胞具有 ，只能分化成 ，不具有发育成 的能力。
(2)成体干细胞
①分布：是 内的干细胞。
②常见类别：包括 中的___________、_________中的__________、____中的___________等；
成体组织或器官内
骨髓、
造血干细胞
神经系统
神经干细胞
睾丸
精原干细胞
组织特异性
特定的细胞或组织
完整个体
发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
多能干细胞
专能干细胞
外周血和脐带血
有着________能力及_____潜能的干细胞，与__________的______________
等密切相关。
自我更新
分化
组织、器官
发育、再生和修复
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值
导致肿瘤发生的风险
3.干细胞的应用
面临的问题存在_____________________
干细胞培养及应用
三
4.诱导多能干细胞
干细胞培养及应用
三
(1)概念：
通过体外诱导__________，获得________________的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称________。
成纤维细胞
类似胚胎干细胞
iPS细胞
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
体外诱导小鼠成纤维细胞
诱导多能干细胞
iPS
多种体细胞
定向诱导分化
干细胞培养及应用
三
(2)应用：
治疗小鼠的镰状细胞贫血；
现在用iPS细胞治疗阿而茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
(3)优点：
①诱导过程_____________
②iPS细胞可以____________________，将它移植回病人体内后，理论上可以_________________；
无需破坏胚胎
来源于病人自身的体细胞
避免免疫排斥反应
因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞
①______________________________________
②______________________________________
③______________________________________
干细胞培养及应用
三
借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞
成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞
(4)制备iPS细胞的其他方法
(5)iPS细胞的来源:
人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
干细胞培养及应用
三
细胞类型 胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞 造血干细胞 神经干细胞 精原干细胞
来源 早期胚胎 骨髓、外周血和脐带血 神经系统 睾丸
作用 分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，具有进一步形成机体、所有组织和器官甚至个体的潜能 只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 特异性 不具有组织特异性 具有组织特异性 应用 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用 将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段 神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)方面有重要的应用价值
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结
小结
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
×
√
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A. 干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B. 造血干细胞可以分化为各种血细胞
C. 不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D. 由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
一.概念检测
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二、拓展应用
练习与应用
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二、拓展应用
练习与应用
1890年，希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体，同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作
1959年，试管家兔诞生，之后，多种试管动物相继出生
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞
1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生，随后多种克隆动物相继问世
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育出了小鼠
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育出了小鼠
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