资源简介

(共31张PPT)
第2节 动物细胞工程
第1课时
动物细胞培养
回顾：
植物细胞工程常用的技术手段有哪些？
植物组织培养、植物体细胞杂交
这些技术的理论基础：
植物细胞的全能性
动物细胞全能性如何？
动物细胞核具有全能性
动物细胞工程
常用技术
动物细胞培养
动物细胞工程
动物细胞工程是应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变动物细胞和创造新的动物细胞，进而培育成新的物种或者品种的一门科学技术。
是其他动物细胞工程技术的基础
动物细胞融合
动物细胞核移植
如：人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产
如：制备单克隆抗体
如：克隆动物
动物细胞培养
从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养时，能否像植物组织培养那样将动物细胞培养成完整个体？为什么？动物细胞培养的原理是什么？
动物细胞特点
分化潜能变窄：动物细胞的全能性随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。
细胞核仍具有全能性：细胞核含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化动物细胞的细胞核仍具有全能性。
不能得到完整个体，得到的是细胞或细胞产物
动物细胞培养原理：
细胞增殖
动物细胞培养的基本条件
多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，阅读资料分析培养时又需要提供哪些必要条件呢？
【资料1】培养的细胞就像体内细胞一样，需要一些基本的营养物质和生长因子，如氨基酸、葡萄糖、无机盐、维生素、核苷酸等。不同组织来源的细胞需要不同的生长因子，而且需求量也不同，所以必须精心设计这些成分的搭配比例。
充足的营养：
培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常还要添加血清。
动物细胞培养基（合成培养基）的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？
主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。
独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等
为什么探究动物细胞培养时，要在培养基中加入血清、血浆等天然成分？
血清和血浆中含有多种维持细胞正常代谢和生长的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等，人体细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚。因此细胞培养时，为保证细胞能顺利生长和繁殖，一般需添加血清、血浆等天然成分
【资料3】人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢就会受到影响。培养的细胞对低温的耐受能力高于对高温的耐受力。
【资料4】开放培养时一般把细胞置于95%空气和5%二氧化碳组成的气体环境中。氧气参与细胞的呼吸作用，二氧化碳可以调节、维持培养基的pH。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4。
适宜的温度、pH和渗透压：
（36.5℃±0.5℃，pH（7.2-7.4）
气体环境：
气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需，CO2维持培养液PH。采用培养皿或松盖培养瓶于95%空气+5%CO2的CO2培养箱中培养。
【资料2】细菌、真菌和病毒等均可造成细胞培养环境的污染，而离体培养的细胞已经失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦受到污染或有毒自身代谢产物积累等，培养的细胞就会死亡。
无菌、无毒环境：
对培养液和培养用具进行灭菌、无菌环境下操作、同时培养液需定期更换，清除细胞代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞造成伤害。
动物细胞培养的基本条件
其它条件：
环境条件是无菌、无毒的环境、适宜的温度、pH和渗透压、适宜的气体环境
充足的营养供给：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
营养条件：
如何进行体外动物细胞培养
动物细胞培养的过程
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
细胞悬液
10代细胞
50代细胞
传代培养
无限传代
单个细胞
加培养液
原代培养
机械的方法或胰蛋白酶或胶原蛋白酶
剪碎
细胞株
细胞系
遗传物质未改变
遗传物质已改变
（分解细胞间质）
洗涤、稀释、分离
10代以内，保持正常二倍体核型
细胞增殖缓慢，核型可能变化
（初次培养）
（分瓶后的培养）
几个有关概念：
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。（将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养，称为原代培养。）
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
思考
1.为什么选择幼龄动物组织、器官？
幼龄动物组织细胞的增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越强，越容易培养。
2.剪碎组织块的目的？
动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。剪碎组织块有利于动物组织充分接触胰蛋白酶。
3.进行动物细胞培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶可以吗？为什么？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。不可以用胃蛋白酶。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4,胃蛋白酶（pH为0.9~1.5)在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时的处理。
胰蛋白酶不会把细胞消化掉，但会对细胞产生一定的影响。
　　任何酶都要适应一定的环境，在人体中尤其重要的是pH，胰蛋白酶产生的时候，是没有生物活性的，当它从胰腺细胞中被分泌出来后进入小肠中，遇到合适的pH但有了生物活性，才能消化蛋白质，而小肠黏膜对小肠上皮细胞又有保护作用，所以胰蛋白酶不不会把细胞消化掉的。
　　在细胞工程中人们普遍使用胰蛋白酶来分散细胞，由于此时酶是处在最有利的环境中，所以在分解细胞间质蛋白的同时，也会对细胞产生一定的影响，（当然不会把细胞完全消化掉），所以在细胞培养过程中使用胰蛋白酶要注意使用的量和时间。
4.胰蛋白酶会不会把细胞消化掉？
5.动物细胞培养为什么要把组织分散成单个细胞？
贴壁细胞的生长增殖除上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。
细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
接触抑制——当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
体外培养的动物细胞分为两类
（1）悬浮在培养液中生长增殖
（2）贴附于某些基质表面生长增殖（此现象叫细胞贴壁）
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累、培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
细胞贴壁过程
接触抑制
(contact inhibition)
培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。
6.分散细胞在培养瓶中培养的特点是什么？ 接触抑制与细胞表面什么结构有关？癌细胞是否存在接触抑制？
①细胞贴壁 ②有丝分裂 ③接触抑制 ④原代培养一般在同一个培养瓶内
细胞的接触抑制细胞培养时，正常细胞增加到一定的密度就不再生长。这种对生长的抑制作用，叫接触抑制。肿瘤细胞失去的接触抑制，在培养基里，密度比正常细胞高得多。这种抑制和细胞表面的糖链有很大的关系。
7.如何解决接触抑制的问题继续扩大培养？如何传代培养？
进行传代培养，原因是原代培养时会出现细胞贴壁和接触抑制，细胞会停止分裂。
8.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
多数组织细胞固定在表面生长和分裂。
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
遗传物质改变
进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，再用离心法收集，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
9.如何解决接触抑制的问题继续扩大培养？
进行传代培养，原因是原代培养时会出现细胞贴壁和接触抑制，细胞会停止分裂。
11.研究细胞正常生理机制通常用传代10代以内的细胞，为什么？
10.动物细胞会不会一直传代下去？
在细胞繁殖过程中，一般只可以繁殖大10~50次，这些细胞称作细胞株。在五十代之后细胞就会大量死亡，剩下可以无限繁殖的细胞，属于癌变细胞，叫细胞系。动物细胞培养技术常将细胞培养至10代以内。
培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。
从首次传代到传至10代：容易传代，传代细胞正常的二倍体核型不会改变。
核型（染色体组型）：一个细胞内所有染色体的大小、形状和数量特性的汇总。
细胞传至10-50代左右时：细胞增殖缓慢，以至于完全停止，此时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。
10-50代之后：如果继续传代培养，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理 细胞的全能性 细胞增殖
培养基性质 固体培养基 液体培养基
培养基特有成分 蔗糖 植物激素 葡萄糖 促- - 动物血清
培养结果 植物体 细胞株、细胞系
培养目的 快速繁殖、培育无病毒植株 获得细胞或细胞分泌蛋白
取材 植物幼嫩部分或花药 胚胎或幼龄动物的器官或组织
其他条件 无菌无毒，适宜条件 无菌无毒，适宜条件
12.比较动物细胞培养与植物组织培养
动物细胞培养技术的应用
1.蛋白质生物制品的生产
酶、生长因子、疫苗、单克隆抗体等
2.应用于基因工程
主要用于受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性
4.细胞的生理、药理、病理研究
（许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。）
利用动物细胞培养技术，解决为烧伤病人植皮问题
动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？
动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。
干细胞（Stem Cells）是一类未分化的细胞或原始细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定的条件下，干细胞可以分化成机体内的多功能细胞，形成任何类型的组织和器官，以实现机体内部建构和自我康复能力。
干细胞工程是在细胞培养技术的基础上发展起来的一项新的细胞工程。
干细胞工程是利用干细胞的增殖特性，多分化潜能及其增殖分化的高度有序性，通过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化或利用转基因技术处理干细胞以改变其特性的方法，以达到利用干细胞为人类服务的目的。
干细胞培养及其应用
什么是干细胞？
是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞
存在：
存在于早期胚胎、骨髓和脐带等多种组织和器官中。
如：造血干细胞属于成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
分类：
根据发育阶段分为：
胚胎干细胞（ES细胞）
成体干细胞
根据分化潜能分为：
全能干细胞
可分化成人体的各种细胞，从而组成各种组织和器官，最终发育成为一个完整的生物体（受精卵）。如：胚胎干细胞
多能干细胞
具有分化多种组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。如：神经干细胞、造血干细胞
专能干细胞
由多能干细胞分化而来，只能向一种类型的细胞分化。如：肝脏干细胞、成肌细胞
存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。如：ES细胞可分化为心肌细胞、神经元、造血干细胞等。
是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等。
特点：
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
有着自我更新能力和分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
成体干细胞 成年动物的许多组织和器官，如表皮和造血系统，具有修复和再生能力，成体干细胞起关键作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
造血干细胞 是体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于骨髓、外周血和脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐带干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。
通过有丝分裂，完成自我更新；
在特定的生理条件下或实验条件下，可以分化成其他类型的细胞。
干细胞特征：
干细胞主要用途：
（1）通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。
（2）自体器官移植
科学家正在研究用胚胎干细胞治疗神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）、糖尿病、心肌坏死等疾病。
（3）神经干细胞可治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。
（4）揭示细胞分化和细胞凋亡的机理。
（5）用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。
胚胎干细胞：
(1)形态上：
(3)在体外培养的条件下，可以只增殖，而不分化。可以冷冻保存，也可以进行遗传改造。
(2)功能上：
体积小、细胞核大、核仁明显。
具有发育的全能性,可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。
用于研究的胚胎干细胞的来源：
一是从自然胚胎中获取；
二是从通过细胞核移植技术克隆得到的胚胎中获取（主要途径）。
来源：
由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，简称ES或EK细胞。
如：造血干细胞可来源于骨髓、外周血、脐带血、胎儿造血系统和胚胎干细胞等。
特点：
（1）治疗人类的某些顽症。
利用ES细胞可以诱导分化形成新的组织 细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。
主要用途
（2）培育出人造组织器官，用于器官移植。
随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。
（3）ES细胞也是研究体外细胞分化的理想材料。
ES细胞在饲养层细胞上，或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。
在培养液中加入分化诱导因子,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化.
1.干细胞研究与社会伦理观念的冲突
2.具体社会情境中的干细胞伦理争议
在干细胞研究中，人类胚胎干细胞研究及其临床转化所引起的伦理争议最大。这主要源于胚胎干细胞的获取过程。由于获得胚胎干细胞的过程会破坏胚胎，由此引出对生命尊严和胚胎伦理地位的讨论，构成了相关研究所面对的主要伦理压力。
由胚胎来源所引发的问题是干细胞研究的另一个伦理争议点。
虽然干细胞尤其是胚胎干细胞研究有巨大的伦理争议，并且已经成为影响干细胞领域发展的一个重要因素；但是，在具体的社会情境下，干细胞伦理争议又会面临更加复杂的局面。在一个国家、地区乃至人类社会，虽然会有一定的、一致的文化传统维系着不同的个体；但不同个体在面对同一个问题时，并不一定表现出一致的看法，他们基于自己的立场可能会表现出不同的态度，从而分化出不同的群体。
人的胚胎干细胞研究与应用的伦理争论
诱导多功能干细胞（iPS细胞）
是由一些多功能遗传基因导入皮肤等受体细胞中通过基因重新编排方法，“诱导”普通细胞回到最原始的胚胎发育状态，能够像胚胎干细胞一样进行分化。
IPS细胞的应用前景
1.用于器官移植。
2.建立疾病模型，了解发病机理。
3.治疗某些遗传病。
如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建立了IPSc，并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状得以缓解。

展开更多......

收起↑