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(共37张PPT)
第1节 重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
（1）提 取
普通大肠杆菌
(不能分泌胰岛素)
人体组织细胞
胰岛素基因
（2）与运载体DNA拼接
（3）导入
大肠杆菌(含胰岛素基因)
（4）转基因大肠杆菌
(能分泌胰岛素)
一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上：
不同生物的DNA在结构上的统一性，几乎所有生物都共用一套密码子。
这种“嫁接”的实现：
这种“嫁接”对品种的改良的意义：
大肠杆菌生产人胰岛素：
基因工程
按照自己的意愿直接定向地改变生物，培育新品种。
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术、基因拼接技术。
基因工程
基因重组
操作水平：
操作原理：
操作对象：
基因
DNA分子水平
操作结果：
定向地改造生物的遗传性状，获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点：
操作环境：
体外
基本过程：
剪切
→拼接
→导入
→表达
定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）
（1）提 取
普通大肠杆菌
(不能分泌胰岛素)
人体组织细胞
胰岛素基因
（2）与运载体DNA拼接
（3）导入
大肠杆菌(含胰岛素基因)
（4）转基因大肠杆菌
(能分泌胰岛素)
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
载体
准确切割DNA的“分子手术刀”：
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”：
DNA连接酶
将体外重组好的DNA导入受体细胞的“分子运输车”：
限制性内切核酸酶
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：
（2）种类：
（3）作用:
磷酸二酯键
主要从原核生物中分离出来。
约4000种。
识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
阅读课本71页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容。
EcoR Ⅰ
限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。
如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。
中轴线
在中轴线两侧切割，形成黏性末端
黏性末端
限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，
它们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。
如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开。
中轴线
在中轴线处切割，形成平末端
平末端
限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
练习： 已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
能
不一定能
1.限制酶在原核生物中的作用是什么？
思考：
因为含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或不具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。（或 自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。）
3.仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
4.限制性核酸内切酶的“限制性”表现在什么地方？这体现了酶的哪种特性？
表现在两方面：
①限制性核酸内切酶只能识别双链DNA分子上某种特定的脱氧核苷酸序列；
②只能在识别序列上特定的两个脱氧核苷酸之间进行切割。
这体现了酶的专一性。
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是一种防御工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，保证自身的安全。
2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
5.在切割含目的基因的DNA分子时，限制性核酸内切酶要切割几个磷酸二酯键？为什么？
4个。DNA分子为双链，且目的基因两端均含有限制性核酸内切酶的识别位点。
6.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
目的基因
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
乙片段
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
完整的DNA分子？
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
使用DNA连接酶连接
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
乙片段
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
完整DNA分子
2.“分子缝合针”—— DNA连接酶
(1)作用：将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
(2)类型：
阅读课本72页“DNA连接酶——分子缝合针”的相关内容。
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要
形成完整的
重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
1.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事么？
思考：
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
2.试比较与DNA相关的五种酶？
归纳总结
与核酸相关的几种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
RNA(水解)酶 磷酸二酯键 将RNA片段水解为单个核糖核苷酸
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
逆转录酶 磷酸二酯键 以RNA为模板，合成DNA
RNA复制酶 磷酸二酯键 以RNA为模板，合成RNA
基因工程用酶
DNA复制用酶
存在于病毒中
(1)DNA分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；
3.不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是什么？
(3)所有生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构；
4.判断
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(　　)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
(5)限制酶也可以识别和切割RNA(　　)
(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　)
×
×
×
×
×
×
3.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
载体作用：
最常用载体：
将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
1.裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
3.在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
构建重组DNA后，如何把重组DNA送入受体细胞呢？
载体种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
质粒
特点：
2.有一个至多个限制酶切割位点。
4.有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
5.对细胞无毒无害。 6.大小适中，便于提取和操作。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。
3.为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？？
1.质粒上有一个或多个限制酶切点，有什么作用？
思考：
大肠杆菌及质粒结构模式图
供外源基因或外源DNA片段插入其中。
2.质粒上有标记基因，有什么作用？
便于重组DNA的筛选、鉴定和选择。
目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。
4.天然的DNA分子为何不可以直接用做基因工程载体？
（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。
这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
（2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
（3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
（4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
（5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
5.形成一个重组质粒会形成几个磷酸二酯键？
四
Hind III和EcoR I
6.下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
1载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
(2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(　　)
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(　　)
(5)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(　　)
7.判断：
×
√
√
√
×
甲
质粒
CTTCATG AATT CCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
GGCATCT TAA
AATTCCGTAG
目的基因
插入
构建
剪切
目的基因
重组DNA
质粒
目的基因
练习：构建重组DNA
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
用EcoRI 剪切目的基因
黏性末端
甲
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
目的基因
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAAGGGATT
质粒
用EcoRI 切割
质粒
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
乙片段
目的基因
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
乙片段
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
构建
重组DNA
（质粒）
目的基因
思考：
3、不同限制酶切割的末端，是否可以用DNA连接酶进行连接？
不一定
1、 用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？
2个
2、用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？
4个
DNA的粗提取与鉴定
一、基础知识
（一)提取生物大分子的基本思路
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA粗提取的基本思路：
（二)提取DNA的基本原理
1.DNA在NaCl中的的溶解性：
当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度如何变化？
如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
溶解：用浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA
析出：加水稀释, 降至0.14mol／L
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
（1）对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。
DNA与蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性有何不同？
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。
3.DNA在酒精溶液中的溶解性
试剂：
（三）DNA的鉴定
条件：
二苯胺
沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
沸水浴
现象：
甲基绿 （绿色）
还有什么可以鉴定DNA？
DNA鉴定时用到什么试剂？需要什么条件？呈现什么颜色？
DNA ＋ 二苯胺试剂
沸水浴
溶液变蓝色
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
洋葱
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
2. 过滤获取含DNA的上清液
二、实验设计
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？
供选材料：（括号内为染色体条数）
新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）
1.选择材料：
思考：
可以用鸡血作为材料么？若可以，怎么处理鸡血？
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
3. 冷却酒精析出DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
4. DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加 加入
用玻璃棒搅拌 无 丝状物溶解
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象 不变蓝 变蓝
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；
二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
三、课题成果评价
是否提取出了DNA？
尝试使用鸡血作为实验材料来进行DNA的粗提取和鉴定。

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