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(共22张PPT)
第3课时
第一章
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
DNA分子电泳
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
变性
90 C
延伸
72 C
复性
50 C
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
③凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
凝胶电泳原理示意图
1.仪器
2.材料
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
微量离心管
微量移液器
电泳装置
PCR仪
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
3.PCR反应体系的配方
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
移液
离心
扩增
1.DNA片段的扩增
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2.DNA片段的电泳鉴定
2.DNA片段的电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
注意
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
　 (2022·天津一中高二期中)下列有关电泳的叙述，不正确的是
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
例1
√
　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
例2
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp
之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
√
1. 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　)
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
C
2.下列有关电泳的叙述,不正确的是 (　　)
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
3.一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量标记。关于该双链DNA,下列说法错误的是 (　　)
A.呈环状结构
B.分子质量大小为10 kb
C.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点
D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2 kb
D
4.(2022·北京朝阳区高二期末)为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。据图分析，下列表述错误的是
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，
其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物
大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
√
实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；
PCR技术中，反应最终的电泳条带
的宽度、亮度与 PCR 起始状态的模板DNA(或者模板)含量呈正相关，B错误；
据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。
5.(2022·河南郑州高二期中)在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是
A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子
B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点
C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp
D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp
√
由图可知，当仅用一种限制酶切割时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该DNA最有可能为环状DNA分子，A错误；
由图可知，当仅用一种限制酶切割DNA时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限
制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在该DNA上各有一个酶切位点，B错误；
由图可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200 bp，C正确；
由图可知，两种限制酶同时切割时则产生
600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最长相距约600 bp，D错误。
第2节 基因工程的基本操作程序

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